无锡市腹泻病人沙门菌的病原学特征及分子分型研究

沙 丹，李 泓，管红霞，冯微宏，肖 勇



无锡市腹泻病人沙门菌的病原学特征及分子分型研究

沙 丹，李 泓，管红霞，冯微宏，肖 勇

目的 分析无锡市腹泻人群中分离的沙门菌的流行特征；同时比较主要血清型菌株间的脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型差异，为沙门菌感染的防控提供实验数据。方法 收集2015年无锡市腹泻病人的粪便标本，分别进行沙门菌的分离鉴定、药敏试验、血清型分型以及PFGE分型分析。结果 756份粪便标本中共分离到32株沙门菌，阳性率为4.23%；检出时间主要集中在5～10月份，感染人群以老年人为主。药敏试验说明无锡地区的沙门菌对氨苄西林的耐药率最高，达56.25%；对环丙沙星和头孢他啶的耐药率最低，均为6.25%。32株沙门菌共鉴定出11种血清型，以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主，分别占31.25%和21.88%。对这2种血清型的沙门菌进行PFGE分析，显示肠炎沙门菌所有带型的相似度均在85%以上，鼠伤寒沙门菌的带型各不相同。结论 无锡市沙门菌的感染具有明显季节和年龄分布差异性，流行的优势血清型为肠炎沙门菌。无锡市需同时加强对食品和环境中沙门菌的监测。

沙门菌；耐药性；脉冲场凝胶电泳；Luminex 200

沙门菌是引起人类感染性腹泻和食物中毒最重要的肠道致病菌之一，在自然界中分布广泛，蛋类、奶类及其制品、肉类等食品均有被其污染的可能，因此每年都有大量由于沙门菌污染食物引起的疾病发生。为了解沙门菌在无锡市腹泻人群中的感染规律和流行特征，本研究对2015年无锡市哨点医院的腹泻病人进行肠道沙门菌的感染监测，揭示沙门菌在本地区的耐药情况及优势血清型，结合脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分子分型，为无锡市沙门菌的临床治疗和暴发流行的追踪溯源提供科学的技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本来源 2015年共采集来自无锡市食源性疾病监测哨点医院756份腹泻病患者的粪便标本，其中男性患者385例，女性患者371例，男女比例为1.04∶1。按照生活状态的不同，将患者分为3个年龄段：1～20岁患者129例、21～60岁患者478例、>60岁患者149例。腹泻定义：每日排便≥3次，且粪便性状异常(稀便、水样便、粘液便或脓血便等)。

1.2 仪器与试剂 改良亚硒酸盐璜绿增菌肉汤(SBG)购自青岛高科园海博生物技术有限公司，三糖铁购自北京陆桥技术有限责任公司，沙门菌显色培养基购自法国科马嘉，VITEK 2 GN鉴定卡购自法国BioMerieu公司，xMAP○RSalmonellaSerotyping Assay Kit购自美国Luminex公司，HotStar Taq○RMaster Mix Kit购自QIAGEN公司，SSI○R沙门氏菌属诊断血清套装购自丹麦SSI公司，蛋白酶K、限制性内切酶XbaⅠ均购自大连TAKARA公司，SeaKem Gold琼脂糖为意大利Lonza公司产品。所有试剂均在有效期内使用。

VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪购自法国BioMerieu公司，Luminex 200多功能流式点阵仪购自美国Luminex公司，Mastercycler○Rep gradient S PCR仪购自德国eppendorf公司，Gel Doc XR凝胶成像系统和CHEF Mapper XA脉冲场凝胶电泳仪购自美国Bio-rad公司。Sensititre(先德)荧光快速微生物鉴定和药敏分析系统购自美国TREK公司，革兰氏阴性致病菌的定制药敏板(编号：PRCDCN2)包含的药物有：氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、四环素、红霉素、氯霉素、头孢唑啉、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、头孢他啶、亚胺培南、萘啶酸、头孢西丁、头孢噻肟、庆大霉素、阿奇霉素。

1.3 菌株的分离鉴定 根据2015年江苏省食源性疾病主动监测工作手册最新检测方法，对采集到的粪便标本进行沙门菌的分离培养，纯培养的可疑菌落经三糖铁初步鉴定后使用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪进行生化鉴定。

1.4 药敏试验 药敏测定采用Sensititre(先德)荧光快速微生物鉴定和药敏分析系统的微量肉汤稀释法(MIC)进行操作。取50 μL 0.5麦氏浓度的菌悬液加入到11 mL CAMHT肉汤中，混匀后取100 μL该肉汤菌悬液加到定制药敏板孔中，在30 min内完成接种。36 ℃培养20 h后，使用Vizion进行读板。以未接种的CAMHT肉汤作为阴性对照，大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株。

1.5 血清型分型 本研究使用Luminex公司生产的xMAP○RSalmonellaSerotyping Assay Kit(SSA)试剂盒对分离到的沙门菌进行血清型分型，聚合酶链反应(PCR)、杂交反应均严格按照SSA试剂盒检测流程和要求操作。

1.6 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 参照美国CDC PulseNet实验室使用的标准化PFGE分子分型方法，对分离纯化的沙门菌进行DNA胶块的制备，经限制性内切酶XbaⅠ酶切后使用CHEF Mapper XA进行脉冲场凝胶电泳分型。电泳条件：电压6.0 V/cm，脉冲参数2.2～ 63.8 s，电泳18.5 h。利用BioNumerics软件读取并聚类分析PFGE电泳图谱。

2 结 果

2.1 流行状况分析 756份粪便标本中共检出32株沙门菌，阳性率为4.23%。沙门菌感染主要集中在夏秋季，尤其是5～10月份，占总检出数的90.62%。年龄分布上，沙门菌感染的高发人群以老年人为主。>60岁患者中共检出10例沙门菌阳性，阳性率为6.71% ；其次是21～60岁患者19例，阳性率为3.97% ；1～20岁患者3例，阳性率为2.33%。男、女沙门菌感染阳性数分别为15例和17例，检出率分别为3.90%和4.58%，差异无统计学意义(χ2=0.22，P>0.05)。

2.2 药敏结果 分离到的32株沙门菌对氨苄西林的耐药率最高(56.25%)，对环丙沙星和头孢他啶的耐药率最低(6.25%)。在本次试验中共有10株沙门菌对氨苄西林、环丙沙星、萘啶酸、头孢他啶、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑均敏感，有2株沙门菌为多重耐药菌，出现了对3类或以上抗菌药物全部耐药的情况。32株沙门菌对这5种抗菌药物的耐药结果见表1。

表1 32株沙门菌对5种抗菌药物的药敏结果

Tab.1 Results of antibiotic resistance for 32 strains ofSalmonella

抗菌药物Antibiotics耐药株(耐药率%)Resistant(%)敏感株(敏感率%)Sensitive(%)氨苄西林(Ampicillin)18(56．25)14(43．75)环丙沙星(Ciprofloxa⁃cin)2(6．25)30(93．75)萘啶酸(Nalidixicacid)16(50．0)16(50．0)头孢他啶(Ceftazidime)2(6．25)27(84．4)甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(Cotrimoxazole)6(18．75)26(81．25)

2.3 血清型分型 32株沙门菌经SSA试剂盒进行血清型分型后，确定了20株沙门菌的血清型别，检出率为62.5%，其余的12株沙门菌无法判断具体的血清型别，仍需使用SSI血清进行进一步的O抗原或H抗原的鉴定。使用SSI血清对所有的沙门菌结果进行复核，已确定型别的20株沙门菌的鉴定符合率为100%。32株沙门菌共鉴定出11种血清型别，以肠炎沙门菌为主，共检出9株，占28.13%，其他依次为鼠伤寒沙门菌8株，占25.0%，伦敦沙门菌4株，占12.5%，阿贡纳沙门菌3株，占9.38%，汤卜逊沙门菌2株，占6.25%。

2.4 PFGE分析 分别对肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌进行脉冲场凝胶电泳分子分型，聚类分析结果显示，9株肠炎沙门菌可分为7种带型，所有带型的相似度均在85%以上。8株鼠伤寒沙门菌的带型各不相同，为高度散发，有3株鼠伤寒沙门菌的带型相似度大于85%。见图1。

图1 肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的PFGE带型聚类图Fig.1 PFGE patterns of the S. enteritidis and the S. typhimurium

3 讨 论

本调查研究显示，无锡地区沙门菌引起的腹泻散发病例占全部腹泻人群的4.23%，阳性病例在老年人群中所占的比例最高，在低龄人群中的感染率最低，这与其他地区的报道有所不同[1-2]。老年人群可能由于长期的餐饮习惯和生活环境的限制，使其暴露于传染源所受到感染的风险较其他人群高。随着无锡地区经济文化的发展，低龄人群的饮食和卫生已经受到家长越来越多的重视和指导，沙门菌在低龄人群中的感染得到了很好的控制。夏秋季是沙门菌感染的高发季节，多是由于人们食用了生冷或不洁的食品导致，说明食品更容易在夏秋季受到沙门菌的污染。在本次调查研究的阳性病例中有1名是从事餐饮业的服务人员，可成为沙门菌感染潜在的传染源，也增加了沙门菌引起食源性疾病暴发事件的可能。

沙门菌属包括了2 500多种血清型别[3]，不同的血清型别携带有不同的抗原，致病能力也不相同[4]。此外由于抗生素在临床治疗和畜牧业的不当使用，使得沙门菌多重耐药的情况日益严重[5-6]，因此监测沙门菌的血清型流行规律和耐药性特征，对沙门菌感染的防治具有重要作用。本研究分别使用两种方法对分离到的沙门菌进行血清型分型，将SSA试剂盒血清分型法与传统的SSI血清凝集法进行比较，结果显示SSA试剂盒血清分型法的血清鉴定率为62.5%，血清鉴定的准确率达100%，未能鉴定的沙门菌需进一步使用SSI血清凝集法进行判定。SSA试剂盒血清分型法可同时对多个沙门菌进行血清鉴定，分型时间控制在一天内，结合SSI血清凝集法比较适用于大批量沙门菌的血清分型鉴定。本次研究中的沙门菌均来源于临床腹泻病人，对32株沙门菌进行药敏试验结果显示，无锡地区的沙门菌对氨苄西林的耐药率最高，而对环丙沙星最为敏感。喹诺酮类和三代头孢菌素是目前临床治疗沙门菌感染的主要药物，本研究分别对这两类药物进行沙门菌的药敏试验，发现无锡地区的沙门菌对三代喹诺酮类的敏感性要高于三代头孢菌素，且三代喹诺酮类的耐药率远低于一代喹诺酮类药物，因此三代喹诺酮类可作为临床治疗的首选药物推荐使用。在32株沙门菌中产生多重耐药菌的比率为6.25%，说明沙门菌在无锡地区的耐药情况尚不严重，但多重耐药菌的出现也提示了沙门菌的耐药前景不容乐观，需引起临床医生的高度重视。

目前沙门菌分子分型在我国运用最多的方法是脉冲场凝胶电泳，其标准化方案为不同实验室之间的比对分析提供了可能，可用于追踪传染源及传播途径，为疫情的控制提供实验室诊断依据[7-8]。沙门菌在无锡地区腹泻人群中流行的优势血清型是肠炎沙门菌，对其进行PFGE分子分型，结果显示9株肠炎沙门菌按100%相似度聚类可分成7个PFGE型别，而按85%相似度进行聚类分析这些肠炎沙门菌均属于同一个PFGE型别。根据TENOVE原则对结果进行判断，本次调查研究中分离的9株肠炎沙门菌在遗传学上可能存在一定的相关性，具有来源于同一个克隆群菌株的可能，说明无锡地区腹泻人群中流行的肠炎沙门菌在流行传播过程中存在着基因变异现象，形成了基因组流行形式的多样性。其他血清型别的沙门菌感染目前均呈高度散发状态，继续监测这些型别沙门菌的流行与分布，对防控沙门菌的暴发感染具有重要意义。流行病学溯源角度，本研究仅对腹泻人群中分离到的沙门菌进行了PFGE分析，缺少对传染源和传播途径的监测调查，因此在今后的工作中还需加强对食品和环境样品中沙门菌的监测工作。

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Pathogenic characteristics and molecular typing ofSalmonellastrains isolated from diarrhea patients in Wuxi City, Jiangsu Province, China

SHA Dan, LI Hong, GUAN Hong-xia, FENG Wei-hong, XIAO Yong

(WuxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuxi214023,China)

We analyzed the pathogenic characteristics ofSalmonellastrains isolated from diarrhea patients in Wuxi City, Jiangsu Province, China and compared the differences among pulse field gel electrophoresis (PFGE) patterns of main serotype strains,so as to provid scientific basis for disease control. After biochemical identification of theSalmonellastrains isolated from infectious diarrhea patients in Wuxi in 2015, drug susceptibility test, serotyping and PFGE were applied to analyze these strains. Results showed that a total of 32Salmonellastrains were detected from 756 diarrhea specimens with a positive rate of 4.23%. The infection occurred more frequently between May and October and adults aged more than 60 years old affected mostly. There was no significant difference between genders in infected population. The drug susceptibility test indicated that the antibiotic resistance rate of theseSalmonellastrains to ampicillin (56.25%) was the highest, and to ciprofloxacin(6.25%) and Ceftazidime (6.25%) were the lowest. The 32Salmonellastrains belonged to 11 serotypes, andS.enteritidis(31.25%) andS.typhimurium(21.88%) were the predominant serotypes. PFGE showed that the pattern similarity of allS.enteritidiswas more than 85%; PFGE patterns ofS.typhimuriumwere different. In conclusion, the infection ofSalmonellafrom diarrhea patients in Wuxi City had obvious season and age specific distribution, and the most prevalent serotype ofSalmonellawas theS.enteritidis. It is necessary to strengthen the surveillance ofSalmonellaconcurrently in food and environment.

Salmonella; antibiotic resistance; PFGE; Luminex 200

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.017

无锡市疾病预防控制中心，无锡 214023

Supported by the Health Bureau Foundation of Wuxi City, China (No. Q201508)

R378.2

B

1002-2694(2017)04-0378-04

2016-04-06 编辑：梁小洁

无锡市卫生局科研项目(No.Q201508)资助