泰安市感染性腹泻非伤寒沙门菌耐药监测及分型研究

张新峰，王 蕾，徐贵永，李 静，胡 彬



泰安市感染性腹泻非伤寒沙门菌耐药监测及分型研究

张新峰1，王 蕾2，徐贵永3，李 静3，胡 彬4

目的 分离鉴定泰安市腹泻病沙门菌的血清型分布、耐药性及PFGE分子分型和同源性特点。方法 对分离自泰安市腹泻病人的粪便标本中的31株沙门菌进行生化鉴定和血清分型，采用微量肉汤稀释法对其进行16种抗生素敏感试验，利用PFGE进行分子分型及聚类分析。结果 31株沙门菌分属于10种血清型，肠炎沙门菌占35.5%(11/31)为优势血清型；31株沙门菌对头孢西丁和亚胺培南100%敏感，对磺胺异唑的耐药率为77.42%(24/31)；31株沙门菌按照100%的相似度可分为17个PFGE型。结论 药敏显示所检测样本存在较为严重的多重耐药性，肠炎沙门菌遗传变异在该地区相对较为保守，且存在散发流行的可能，提示应做好肠炎沙门菌传染病的早期预警及防控。

腹泻；沙门菌；血清型；耐药；脉冲场凝胶电泳预警；防控

沙门菌广泛存在于自然界，是一类危害人类和动物健康的重要病原菌，也是引起腹泻的主要病原菌之一。为掌握泰安市沙门菌的流行和耐药情况，依托“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项——腹泻病症候群监测技术平台项目，于2012—2015年从泰安市所辖4个县市区哨点医院收集的感染性腹泻病例粪便标本中分离沙门菌，进行血清型研究和药敏试验，并用PFGE分型方法对流行菌株进行分子分型，以揭示菌株之间的同源性。为控制沙门菌感染，指导临床合理使用抗生素和防控食源疾病提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 标本来自泰安市4个县市区哨点医院肠道门诊。采集腹泻病人粪便标本于Cary-Blair运送培养基，4 h内送到泰安市疾病预防控制中心进行肠道致病菌分离，并对检出的沙门菌进行鉴定、血清学、耐药性检测脉冲场电泳分子分型溯源。

1.1.2 仪器与试剂 AS4德灵半自动生化分析仪，Thermo全自动药敏分析仪，Bio-Rad脉冲场凝胶电泳仪，Bio-Rad凝胶成像系统。Cary-Blair运送培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，SBG增菌液、营养琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司；SS琼脂、麦康凯琼脂为北京陆桥技术有限责任公司产品，革兰氏阴性菌生化鉴定板(德灵公司)，沙门菌诊断血清购自泰国S&A公司；微量细菌定量(MIC)药敏试剂盒购自天津金章科技发展有限公司；SeaKemGold琼脂糖，10×TBE缓冲液购自美国Bio-Rad公司；SDS、蛋白酶K购自美国Sigma公司；限制性内切酶XbaI购自大连宝生物；PFGE相对分子量标准用布伦登卢普沙门菌，H9812由中国疾病预防控制中心传染病所提供。其它培养基均由北京路桥技术有限责任公司生产。所有试剂、培养基均在有效期内使用。

1.2 方法 依据国家科技重大专项课题《自然疫源性传染病病原谱流行规律及变异研究》及其子课题《症候群细菌学研究》中的腹泻病症候群监测技术方案进行相关检测。

1.2.1 沙门菌的分离鉴定和血清分型 使用AS4德灵半自动生化分析仪，参照WS 280-2008《伤寒和副伤寒诊断标准》[1]及GB 4789.4-2010《食品微生物学检验 沙门氏菌检测》[2]进行沙门菌的分离鉴定。血清分型方法按照泰国S&A公司提供的沙门菌血清诊断操作步骤进行，根据Kauffmann-hite表确定沙门菌的血清型。

1.2.2 药敏试验 采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法[3]，参照CLSI微生物药物敏感性试验执行标准进行结果判定，判断结果分为敏感、中介和耐药3种。依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准M100-S20，利用96孔板微量肉汤稀释法对环丙沙星、链霉素、氨苄西林、氯霉素、磺胺异恶唑、复方新诺明、萘啶酸、阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松、强力霉素、庆大霉素、阿奇霉素、四环素、头孢西丁、头孢吡肟、亚胺培南16种不同类别的常用抗生素进行试验及结果判读，质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922(中国疾病预防控制中心传染病所提供)。

1.2.3 PFGE分型 参照美国PulseNet PFGE标准化分型方法进行。沙门菌经琼脂糖固定、裂解、洗涤后，包埋的DNA在37 ℃水浴中使用40U的XbaI酶切至少2 h。得到的DNA片段使用Chef Mapper 脉冲场凝胶电泳分型，电泳缓冲液为0.5×TBE，电泳时间为18.5 h，电泳温度为14 ℃，脉冲时间为2.16～63.8 s。胶使用GelRed染色后成像。

1.2.4 数据分析 统计学处理用SPSS 17.0软件进行数据分析。资料的描述主要使用率(%)，统计学分析采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。PFGE成像结果使用BioNumerics 6.6软件采用UPGMA方法进行聚类分析，PFGE带型之间的相似度采用Dice系数衡量，确定沙门菌的基因型和同源关系。

2 结 果

2.1 沙门菌的分离 2012—2015年期间，泰安市4个县市区的监测点共发现513例腹泻患者，共检出沙门菌31株，检出率为6.04%。4个县市区哨点医院沙门氏菌检出率分别为：泰山区4.69%(16/341)，岱岳区3.23%(2/62)，宁阳县8.45%(6/71)，新泰市17.95%(7/35)。各县市区哨点医院的检出率差异具有统计学意义(χ2=12.424，P=0.006)；另外，31例沙门氏菌感染者中年龄3岁以下的人群占54.84%(17/31)。

2.2 菌株的血清型分布 31株血清分为10个血清型，其中肠炎沙门菌共11株，占35.48%(表1)，为泰安市沙门菌的优势菌种；婴儿沙门菌6株，鼠伤寒沙门菌5株，德尔卑沙门菌3株，都柏林沙门菌2株，其他血清型菌株包括法斯塔、加里玛、罗安达、山夫登沙门氏菌各1株；各哨点医院中，新泰市肠炎沙门菌5株(5/7)，宁阳县鼠伤寒沙门菌3株(3/6)，泰山区婴儿沙门菌4株(4/16)，血清型在各县区哨点医院的分布差异没有统计学差异(表1)(P=0.129，95%CI=(0.011-0.247))。

表1 31株沙门氏菌各血清型的哨点医院分布和构成比(%)

Tab.1 Regional sentinel hospital distribution and constituent ratios (%) of different serotypes of 31 non-typhoidSalmonellaisolates

血清型Serotypes各地区哨点医院分布Regionalsentinelhopitaldistribuion菌株数Isolates泰山区TaishanDistict新泰市XintaiCity宁阳县NingyangCouny岱岳区DaiyueDistrict合计Total构成比(%)Constituentratio(%)肠炎S．enteritidi45111135．48婴儿S．infatis4110619．35鼠伤寒S．typhimuium0131516．13德尔卑S．drby3010412．90都柏林S．dulin200026．45其他∗Others300039．68合计Total1676231100

*其他包括法斯塔、加里玛、罗安达、山夫登沙门氏菌。

2.3 药敏试验 31株沙门菌全部对头孢西丁和亚胺培南敏感(100%)，只有1株对庆大霉素耐药，对磺胺异恶唑的耐药率为77.42%(24/31)，对氨苄西林和萘啶酸的耐药率为64.52%(20/31)，对链霉素和阿奇霉素的耐药率为58.06%(18/31)，另外有1株婴儿沙门菌对11种药物耐药，4株沙门菌对9种药物耐药，24株对3种及以上的药物耐药；泰山区16株沙门菌与其他地区15株沙门菌对磺胺异噁唑的耐药率分别为37.5%(6/16)、86.67%(13/15)，差异具有统计学意义(P=0.009)；对氨苄西林的耐药率分别为56.25%(9/16)、100%(15/15)，差异具有统计学意义(P=0.17)(表2)；另外除2012年菌株较少外，2013—2015年，菌株的抗生素耐药性范围不断扩大，多重耐药情况比较严重(表3和图2)。

图1 2012-2015年泰安市31株沙门菌对16种抗生素的耐药性分布Fig.1 Antibiotic resistance distribution of 31 Salmonella strains to 16 antibiotics in Tai’an City in different years between 2012 and 2015

2.4 PFGE分型 31株沙门菌按照100%的相似度可分为17个PFGE型，分别命名为P1-P17。其中优势菌P16型共7株，P14和P15型各3株，P1、P2、P3型各2株，其余10个型相互独立。全部31株沙门菌的相似度均在56%～100%之间，根据带型相似度≥85%归为同一克隆系的原则(聚类)[5]，31株沙门菌可分为3组大的克隆系，其中克隆系Ⅰ共7株，克隆系Ⅱ共6株，克隆系Ⅲ共11株(图2)。

图2 泰安市31株沙门菌PFGE分型结果Fig.2 PFGE typing results among 31 strain of Salmonella in Tai’an City

表2 泰安市31株沙门菌对16种抗生素的药敏结果分析(%)

表3 2012—2015年泰安市31株沙门菌对16种抗生素的耐药谱分布(%)

Tab.3 Distribution of resistant spectrum of 31Salmonellaisolates to 16 antibiotics in Tai’an City，2012-2015

抗生素Antibiotics菌株数(%)2012年2013年2014年2015年环丙沙星Ciprofloxacin0(0)1(14．29)3(25)2(22．22)链霉素Streptomycn0(0)2(28．57)12(100)4(44．44)氨苄西林Ampicillin0(0)6(85．71)7(58．33)7(77．78)氯霉素Chloramghenicol0(0)2(28．57)5(41．67)3(33．33)磺胺异恶唑Sulfamethox⁃azole0(0)4(57．14)11(91．67)9(100)复方新诺明Sulfamethox⁃azole0(0)1(14．29)4(33．33)2(22．22)萘啶酸Nalidixicacid2(66．67)3(42．86)10(83．33)5(55．56)阿莫西林-克拉维酸钾Amoxicillin⁃cla⁃vulanatepotas⁃siu0(0)2(28．57)2(16．67)7(77．78)头孢曲松Ceftriaxon0(0)4(57．14)3(25)0(0)强力霉素Doxycyclin0(0)2(28．57)3(25)5(55．56)庆大霉素Gentamicin0(0)1(14．29)0(0)0(0)阿奇霉素Azithromycn2(66．67)4(57．14)10(83．33)0(0)四环素Tetracycline0(0)2(28．57)1(8．33)5(55．56)头孢西丁Cefoxitin0(0)0(0)0(0)0(0)头孢吡肟Cefepime0(0)3(42．86)0(0)0(0)亚胺培南Imipenem0(0)0(0)0(0)0(0)合计3(100)7(100)12(100)9(100)

3 讨 论

沙门氏菌属是一类危害人类和动物健康的重要致病菌，其血清型别繁多，抗原复杂，是引起腹泻的主要病原菌之一。本次研究发现，泰安市沙门菌感染者主要以年龄<6岁的人群为主(58.06%)，尤其是年龄<2岁的婴幼儿(51.61%)。原因是沙门菌感染的人群特征是学龄前儿童高发，特别是0～2岁的婴幼儿占很大比例，可能因为自身免疫系统不完善而易感染[6]，或者儿童年幼尚未养成良好的卫生习惯。另外新泰市哨点医院腹泻患者的沙门菌检出率明显高于其他县市区，原因可能是哨点医院的诊断标准不一，也可能是新泰市人民的饮食生活习惯等原因造成的。此外，粪便标本的运输途径、储存条件和检测时间等因素也有可能造成不同哨点医院沙门菌阳性标本检出率的不同[7]。

血清学分型是沙门菌的传统分型方法，到目前为止已鉴定2 500多种[8-9]，血清型的正确鉴定对确定沙门菌病的感染源及控制减少发病率具有重要意义。本次研究发现泰安市沙门菌感染以肠炎沙门菌为优势血清型(35.48%)，其次是婴儿沙门菌(19.35%)和鼠伤寒沙门菌(16.13%)。此结果和北京市的研究结果大体相似，都是以肠炎沙门菌为优势血清型[10]，但长沙市[11]、深圳市[12]、广州市[13]的研究显示，鼠伤寒沙门菌为优势血清型，和本文结果有一定差异性。沙门氏菌的血清型可能存在地域性分布差异，可能与南北方的气候差异和居民的饮食习惯有关，也可能是本次研究样本量较小的原因。另外，沙门菌的血清分型在泰安市各县市区哨点医院的分布差异没有统计学差异，提示泰安市卫生部门可以制定统一的沙门菌感染防控和治疗的措施。

由于抗生素的广泛使用和滥用导致包括沙门菌在内的很多病原菌出现了多重耐药性，且全球范围内沙门菌分离株的耐药性在逐渐增强[14]。本次药敏分析结果发现泰安市31株沙门菌全部对头孢西丁和亚胺培南100%敏感，对庆大霉素敏感率96.77%(30/31)，与侯君等[15]结果相似，对磺胺异恶唑的耐药率为77.42%(24/31)，但存在较为严重的多重耐药现象，发现1株婴儿沙门菌对11种抗生素耐药，另有24株(24/31)对3种及以上的抗生素耐药；统计发现泰山区部分药物的耐药性明显低于其他县市区，差异具有统计学意义，泰山区是泰安市发展较为全面的地区，在医疗卫生方面有突出成绩，聚集了全市先进的卫生资源和优秀医疗人才，其他县市区应学习泰山区的先进检验，提高传染病防治能力。

脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术是由Schwartz和Cantor[16]提出，发展至今以其重复性好、分辨力强而被称为细菌分子生物学分型的“金标准”[17]。PFGE结果可用于描述病原菌的遗传特性，结合流行病学资料进行疾病溯源，并为临床诊断和治疗提供分子生物学依据等[18]。本研究发现泰安市沙门菌的同源性较强，全部31株沙门菌的相似度均在56%～100%之间，且克隆系Ⅲ共11株。相似度在100%的3个条带14TANY001、2014TA056和TADY16分别是宁阳2014年1月、7月和岱岳区2014年8月的病例，表明肠炎沙门菌在泰安存在散发流行的可能，且该流行株肠炎沙门菌遗传变异在该地区较为保守，与林文娟等[6]报道的一致而与曲梅等[19]的结果相反。提示应做好肠炎沙门菌传染病的早期预警及防控。另外本研究PFGE型与血清型分析结果显示，同一PFGE型可分为相同或不同的血清型，例如：14TANY001、2012046TA分别为肠炎和都柏林两个血清型，此研究结果与长沙市[11]的研究结果相一致。但PFGE型与血清型和耐药性之间的流行病学关系尚待进一步研究。

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Hu Bin, Email：wubz9670@126.com

Drug resistance and molecular typing of nontyphoidSalmonellaof infectious diarrhea in Tai’an City, China

ZHANG Xin-feng1, WANG Lei2, XU Gui-yong3, LI Jing3, HU Bin4

(1.Tai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000，China; 2.LaiwulenterforDiseaseControlandPrevention,Laiwu271000,China； 3.TaishanDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000，China; 4.ShandongCenterforDiseaseControlandPrevention,Jinan250000，China)

We investigated the serotype, drug resistance features, molecular types, and homology ofSalmonellain diarrhea in Tai’an City, and provided scientific evidences for warning, control and clinical treatment. The 31Salmonellastrains isolated from stool specimens of diarrhea in Tai’an were identified by serotyping. Broth dilution technique was used to test the sensitivity of 31 strains ofSalmonellato 16 antibiotics. Pulsed field gel-electrophoresis (PFGE) was used for molecular typing and cluster analysis. Results showed that 31 strains ofSalmonellawere divided into 10 kinds of serotype.S.enteritidis(11/31) was the predominant serotype. All 31 strains ofSalmonellawere sensitive to cefoxitin and imipenem. The drug resistance rates of the 31 strains ofSalmonellawere 77.42 % (24/31) to sulfafurazole. The 31 strains ofSalmonellawere divided into 17 patterns by PFGE, with 100% similarity for each pattern. All the results suggest that there are more serious problems in multiple drug resistance. The genetic variation ofS.enteritidisis relatively conservative. Early warning and control onS.enteritidisare exposed to reinforce.

diarrhea;Salmonella; serotype; drug resistance; PFGE; early warning; control

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.009

国家科技重大专项课题(No.2012ZX10004-201-002)资助

胡 彬，Email：wubz9670@126.com

1.山东省泰安市疾病预防控制中心，泰安 271000； 2.莱芜市疾病预防控制中心，莱芜 271000； 3.泰安市泰山区疾病预防控制中心，泰安 271000； 4.山东省疾病预防控制中心，济南 250000

Supported by the National Major Science and Technology Project ( No.2012ZX10004-201-002)

R378.2

A

1002-2694(2017)04-0337-06

2016-08-16 编辑：李友松