青海省251株结核分枝杆菌Spoligotyping基因型与4种一线药物耐药表型的研究

王兆芬，李 斌，蒋明霞，马永成，汪海静，申秀丽，姚雪琼，李婷婷，陈 英，王新华



青海省251株结核分枝杆菌Spoligotyping基因型与4种一线药物耐药表型的研究

王兆芬1，李 斌1，蒋明霞2，马永成2，汪海静1，申秀丽1，姚雪琼1，李婷婷1，陈 英1，王新华1

目的 研究青海结核分枝杆菌对4种一线抗结核药物耐药状况及与Spoligotyping基因型的关系，为结核病有效预防提供依据。方法 采用常规比例法对分离的251株结核分枝杆菌进行异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)等4种一线抗结核药物的药敏试验，并对菌株进行Spoligotyping分型，对药敏试验和基因分型结果进行综合分析。结果 251株结核分枝杆菌中，总耐药率为56.2%；对INH、RFP、SM和EMB的耐药率分别为43.0%(108/251)、37.1%(93/251)、39.0%(98/251)和27.9%(70/251)；耐多药率为31.5%(79/251)。所有菌株经Spoligotyping分型，分为北京基因型185株(73.7%)与非北京型菌株66株 (26.3%)。未发现北京型与非北京型结核菌株与耐药存在统计学关联。结论 青海流行的结核分枝杆菌耐药率及多耐药率较高，Spoligotyping分型显示北京基因型为主要流行型。

结核分枝杆菌；耐药；寡核苷酸序列分型

结核病(Tuberculosis, TB)是目前全球最重要的公共卫生问题之一，耐多药结核(Multidrug-resistant TB, MDR TB)的流行更是加剧了结核病对人群的威胁。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)2015年度报告，2014年世界上有960万结核病新发病例，共有150万人因结核死亡，19万人死于耐多药结核病；估计全球耐多药患者48万[1]。中国是结核病高负担国家，2014年结核发病人数93万，位居第3，耐多药患者约5.2万[1]。随着分子生物学的发展，基因分型方法在结核分枝杆菌分型工作中的应用逐渐得到完善。DR区的寡核苷酸序列分型方法(Spacer Oligonucletide Typing, Spoligotyping)是以PCR为基础的一种快速分型方法。本研究对青海省分离的251株结核菌进行了Spoligotyping分型及耐药检测，并进行了基因型与耐药情况的分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与鉴定 251株结核分枝杆菌临床分离株由青海省疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病实验室提供，对照标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病实验室提供。结核分枝杆菌的分离及鉴定根据《结核病诊断细菌学检验规程》进行，病原分离采用改良罗氏培养基，菌型鉴定使用鉴别培养基培养法，本实验研究中251株菌均为结核分枝杆菌。

1.2 药敏试验 采用WHO/国际防痨和肺病联合会(WHO/IUATLD)推荐的比例法[2]，分别对异烟肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampin, RFP)、链霉素(streptomycin, SM)和乙胺丁醇(ethambutol, EMB)等4种一线抗结核药物进行药敏试验。

1.3 Spoligotyping分型 对本研究的251株结核分枝杆菌进行Spoligotyping分析，H37Rv为实验阳性对照。参照的方法为国际标准的43个寡核苷酸位点的寡核苷酸杂交实验技术[3]。

1.4 数据分析 将Spoligotyping实验结果进行数字转化，并与SpolDB 4.0数据库[4]进行比对分析确定菌株的类型。通过药敏试验鉴定菌株耐药情况，运用SPSS 20.0统计软件进行检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 药敏试验 251株结核分枝杆菌分离株中，对1种或1种以上药物耐药者有141株，总耐药率为56.2%，其中耐INH药物的结核菌株有108株(43.0%)、耐RFP药物的有93株(37.1%)、耐SM药物的有98株(39.0%)、耐乙胺丁醇药物的有70株(27.9%)，耐多药菌株79株(31.5%)。

2.2 Spoligotyping分型 通过与SpolDB4.0数据库进行比对分析，北京基因型有185株(73.7%)，MANU2型基因型有8株(3.2%)，U型基因型有9株(3.6%)，T1型基因型有3株(1.2%)，H4型基因型有1株(0.4%)，其他类型基因型45株(17.9%)。表1为251株结核分枝杆菌Spoligotyping分型结果。

表1 251株结核分枝杆菌Spoligotyping分型结果

Tab.1 Results of genotyping of 251M.tuberculosisisolates with spoligotyping

SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□■■■■□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□■□□□□□□□□□■□■■□□□□■■□□■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃⁃⁃NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□□■■■■■■■■■⁃⁃NEW2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■1Beijing156(62．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□⁃⁃like⁃Beijing16(6．4)表1(续)SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■190like⁃Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□⁃⁃like⁃Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□■■■■□⁃⁃like⁃Beijing3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■□■□⁃⁃like⁃Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□■■□⁃⁃like⁃Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□□□■■□⁃⁃like⁃Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■□□⁃⁃like⁃Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■□□⁃⁃like⁃Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□□□□□⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■54MANU27(2．8)■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■583MANU21(0．4)■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■523U9(3．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■⁃⁃NEW4(1．6)■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■53T13(1．2)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□■■■■■□■■■⁃⁃NEW1(0．4)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□□□■■■■■■■127H41(0．4)■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■□□□□■■■■■■■⁃⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■□⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■■⁃⁃NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■■■■■■■■□■■■⁃⁃NEW4(1．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■■■■■■■■■□■■■⁃⁃NEW2(0．8)■□■■■■□■■■■□■■□□□■■□□□□■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■⁃⁃NEW1(0．4)

2.3 不同基因型与耐药相关分型 本研究未发现北京基因型及非北京型结核分枝杆菌与耐药性之间存在关联，见表2。

表2 不同基因型与耐药相关分析

Tab.2 Correlation between genotypes and drug resistance

ResistancephenotypesNo．ofisolates251(%)GenotypesBeijing185(%)non⁃Beijing66(%)χ2POnlyresistanttoINH5(2．0)4(2．2)1(1．5)0．0001．000OnlyresistanttoRFP11(4．4)5(2．7)6(9．1)3．3360．068OnlyresistanttoSM13(9．6)9(4．9)4(6．1)0．0030．958OnlyresistanttoEMB4(1．6)4(2．2)0(0．0)1．4500．229MDR79(31．5)55(29．7)24(36．4)0．9930．319TotalResistance141(56．2)101(54．6)40(62．5)1．2100．271

Note：MDR is resistant to both isoniazid and rifampin.

3 讨 论

北京基因型结核分枝杆菌是引起全球结核病流行的优势菌株，占全球分离的结核分枝杆菌菌株的13%，在东亚地区更是达到50%以上[5]。此前有研究表明，我国北方地区北京基因型菌株所占比例高于南方地区[5]，这可能与北方地区的地理环境、气候条件、人口构成等因素有关，同时也表明北京基因型菌株可能存在特殊的地域性。本研究251株结核分枝杆菌中，通过Spoligotyping方法进行基因分型，结果显示，在青海省主要流行的结核菌株为北京型(73.7%)，这个结果与之前其他人所做结果一致[6-7]。

结核分枝杆菌耐药性的产生机制复杂，可能与基因突变及菌体蛋白表达差异等有关[8-9]。耐药结核病的流行，使结核病的防治面临严峻挑战，亚洲和非洲尤甚[1]。全国结核病耐药性基线调查报告显示：我国肺结核病患者中耐药率为37.8%，耐多药率为8.3%[10]。2015年世界卫生组织的全球结核病报告显示，我国新发耐多药结核病率为19%，复发耐多药结核病率为54%[1]。

本研究实验结果显示：青海地区流行的结核菌株对一线4种抗结核药物1种或1种以上药物耐药者有141株，总耐药率为56.2%，远高于抽样调查的全国平均水平36.8%[11]。有研究认为北部省份耐药率偏高，主要原因可能是北部省份经济发展水平较南方差，气候较为寒冷，居民室内活动时间较长，易于传染等[12]。本研究发现青海地区251株结核分枝杆菌，耐INH药物的结核菌株有108株(43.0%)、耐RFP药物的有93株(37.1%)、耐SM 药物的有98株(39.0%)、耐EMB药物的有70株(27.9%)，这与米热班·热夏提等的研究结果一致[13]，但与车洋等人[14]的研究结果有差异，提示各地区结核耐药情况有所区别。青海地区一线药物耐多药率高达31.5%(79/251)，远高于一线抗结核药物全国耐多药率6.8%[11]。不同地区结核分枝杆菌的耐药率有所不同，在治疗结核病时，需要根据当地耐药特征选择适当的敏感药物。青海高耐药率与高耐多药率的原因需要进一步研究。

由于北京型菌株在全球流行广泛，有研究者报道北京型结核分枝杆菌与耐药无关[15-17]，但也有研究发现此基因型菌株与耐药性存在相关[18]。本研究结果显示，青海地区北京型结核分枝杆菌与非北京型结核分枝杆菌的耐药率差异不明显，菌株分型与耐药率之间无统计学关联(P>0.05)。以后的研究中尚需要进一步观察。

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Investigation on spoligotyping and phenotypes of drug resistance to four first-line drugs in 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai, China

WANG Zhao-fen1, LI Bin1, JIANG Ming-xia2, MA Yong-cheng2, WANG Hai-jing1, SHEN Xiu-li1, YAO Xue-qiong1, LI Ting-ting1, CHEN Ying1, WANG Xin-hua1

(1.PublicHealthDepartmentofMedicalSchool,QinghaiUniversity,Xining810001,China; 2.InstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,QinghaiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xining810007,China)

This study aims to learn drug resistance situation of four first-line anti-TB drugs among 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai and to explore their relationships with genotypes by Spoligotyping, so as to provide basis for effective prevention of tuberculosis. Isolates of 251M.tuberculosiswere tested susceptibilities of four first-line drugs including isoniazid (INH), rifampicin (RFP), streptomycin(SM) and ethambutol (EMB) by using conventional proportion method and genotyped by Spoligotyping. Relationship between drug resistance and genotypes was analyzed statistically. Results showed the total drug resistance rate was 56.2% (141/251) among 251M.tuberculosisisolates. Resistance rates of four first-line drugs were 43.0% (108/251) for INH, 37.1% (93/251) for RFP, 39.0% (98/251) for SM, 27.9% (70/251) for EMB respectively. Rate of multidrug-resistant TB (MDR TB) was 31.5% (79/251). All 251 isolates ofM.tuberculosiswere typed by spoligotyping. The 185 (73.7%) were Beijing genotypes and 66 (26.3%) were non-Beijing genotypes, and no statistical association was found with drug resistance. This paper concludes that isolates ofM.tuberculosisprevail in Qinghai have both high rates of drug resistance and MDR and dominant isolates are Beijing genotypes by spoligotyping.

Mycobacteriumtuberculosis; drug resistance; spoligotyping

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.008

国家自然科学基金(No.81660556)；青海省科技厅项目(No.2014-ZJ-910)联合资助

1.青海大学医学院公共卫生系，西宁 810001； 2.青海省疾病预防控制中心传染病预防控制所，西宁 810007

Supported by the National Natural Science Foundation (No.81660556) and Qinghai Science and Technology Commission (No.2014-ZJ-910)

R378.9

A

1002-2694(2017)04-0332-05

2016-06-06 编辑：张智芳