兽药残留检测中磺胺嘧啶ELISA试剂盒的研制

田 博,金 坚,惠人杰,徐凤莲,吴 涛,李 伟

(1.江南大学药学院，江苏无锡214122； 2.无锡同昕生物技术有限公司,江苏无锡214028)



兽药残留检测中磺胺嘧啶ELISA试剂盒的研制

田 博1,2,金 坚1,惠人杰1,徐凤莲2,吴 涛2,李 伟2

(1.江南大学药学院，江苏无锡214122； 2.无锡同昕生物技术有限公司,江苏无锡214028)

以合成的耦联抗原BSA-磺胺嘧啶和磺胺嘧啶(SD)的单克隆抗体为材料,建立了SD间接竞争ELISA的方法。方法的检测灵敏度为0.213 ng/mL,线性检测范围为1.84～57.41 ng/mL,除与磺胺二甲嘧啶反应率超过10%外,与其他磺胺类药物交叉反应率均低于1.5%,4 ℃放置180 d没有明显的变化。采用猪尿、牛奶、猪肉3类样本进行的添加回收实验,批内CV均小与10%，批间CV小于15%，平均添加回收率介于75%～90%。因此，组建的试剂盒可以满足动物饲养检测SD的要求。

磺胺嘧啶;间接竞争ELISA;回收实验;交叉反应率

动物性食品中兽药和饲料添加剂的残留对环境和人体健康的危害已成为现在亟待解决的问题之一,其中，磺胺类药物特别是磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲基异恶唑等作为饲料添加剂或动物疫病治疗药物的不合理用药在动物性食品中的残留已受到国际社会的普遍关注[1-2]。我国以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中磺胺嘧啶的最高残留限量为0.1 mg/kg。目前，检测磺胺嘧啶残留的常用方法主要是高效液相色谱法(HPLC)[3]和酶联免疫吸附试验法(ELISA)[4-5],后者作为磺胺嘧啶残留检测方法，具有适用于临床使用方便的优势。ELISA是一种应用比较成熟的超微量定量分析方法，不仅通量适可、简便易行而且经济，目前所用装备均已可以国产化生产，能够适于基层单位普及应用。由于动物性食品中磺胺嘧啶残留分析样品具有一定的特殊性，而已有相应ELISA对样品分析的适用度尚有许多局限，因此开发更具实用价值的磺胺嘧啶ELISA十分必要。

图1 磺胺嘧啶的结构式Fig.1 Structure of sulfadiazine

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

包被抗原BSA-SD由同昕生物技术公司合成；SD单克隆抗体，标准品稀释液分别购自美国YKD公司、上海谱振生物科技有限公司；42592 Costar 96孔酶标板，上海蔚宏生物科技有限公司；ELISA洗板机，厦门瑞博欣仪器设备有限公司；LSY-300型酶标仪，深圳绿诗源生物技术有限公司；其他化学试剂，市售国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 BSA-SD的合成

采用戊二醛法进行BSA-SD耦联抗原的合成，分析并计算BSA与SD的耦联比为1∶ 5，可用于实验过程中酶标板的包被。

1.2.2 包被抗原BSA-SD与SD单克隆抗体工作浓度的确定

以方阵滴定法[6]确定包被抗原BSA-SD与SD单克隆抗体(SD-mAb)的最佳工作浓度。以0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液配置已优化的BSA-SD包被浓度，4 ℃过夜包被的96孔酶标板后，用0.01 mol/L、pH 7.4磷酸盐(PBS)缓冲液洗板3次,每次浸泡2～3 min。去除洗板液，加入含0.1%明胶的抗体稀释液37 ℃放置2 h封闭后烘干备用。

1.2.3 竞争ELISA方法的建立

用标准品稀释液溶解SD，定容并逐级稀释配制SD标准品，最终质量浓度分别为81、27、9、3和1 ng/mL。然后按下列操作进行[7]：1)设置0标准点，按SD标准品溶液梯度加入50 μL/孔。每孔加入50 μL SD-mAb，25 ℃温育30 min，含0.1%明胶的0.01 mol/L、pH 7.4 PBS缓冲液洗板3次。2)加入1∶ 4 000比例稀释的酶标羊抗鼠IgG，25 ℃温育30 min后，洗板5次。3)加入50 μL/孔TMB的磷酸-柠檬酸缓冲液避光显色15 min，再加入50 μL/孔2 mol/L 稀H2SO4终止反应后，酶标仪(450 nm)测定吸光度值OD。

1.2.4 竞争ELISA的参数优化

1)包被条件优化[8-9]。分别设置包被条件为37 ℃、2 h,4 ℃过夜和37 ℃温育2 h后4 ℃过夜为分析最佳包被条件。

2)包被缓冲液的优化。对比3种包被缓冲液:0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.4),0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9.6)和NaCl生理盐水，选择最佳的包被缓冲液。

3)竞争反应时间的优化。分别设置竞争反应时间为0.5、1和1.5 h，选择最优的竞争反应时间。

4)显色反应时间的优化。将显色时间分别设置为10、15和20 min，对比所得吸光度值确定最佳的显色反应时间。

1.2.5 空白样品添加回收实验

在尿液、牛奶和猪肉中添加不同浓度的SD标准品，通过实验结果计算添加回收率和批内、批间变异系数(CV)来确定其准确度。尿液(猪尿)样品用3个不同批次的酶标板分别进行实验；每个批次均选择3个标准品浓度进行添加，且每个添加浓度设置3个平行组；SD标准品添加完成混匀后经3 000 r/min离心5 min，取上层1 mL清亮尿液移至10 mL玻璃管中，经4倍稀释用于检测，SD的终质量浓度分别为3、6和15 ng/mL。向牛奶样本中添加SD标准品，离心10 min后吸除上层脂肪,经20倍稀释用于检测。猪肉组织样本匀浆后称取2 g，添加SD标准品；取50 mL于离心管内并加入8 mL乙腈,振荡器振荡20 min后3 000 r/min离心5 min；取2 mL上清移至玻璃管中，56 ℃N2吹干；加入正己烷和PBS缓冲液溶解，离心10 min去除上层正己烷相，取下层液相用于检测。

1.2.6 特异性

通过竞争ELISA方法分别测定SD以及磺胺喹恶啉、磺胺二甲嘧和磺胺异恶唑的IC50,比较交叉反应率CR(cross-reactivity,磺胺嘧啶的IC50/其他药物的IC50× 100%)来判断方法对于SD检测的特异性。

1.2.7 稳定性

将试剂盒于4 ℃环境条件下放置0、30、90和180 d后，分析标准曲线的漂移,比较检测牛奶样品的数据变异系数(CV)的大小。

2 结果与讨论

2.1 包被抗原BSA-SD与抗体SD-mAb工作浓度的确定

对实验数据进行系列对比,结合实验原料经济性等因素，确定竞争ELISA反应实验的抗原包被质量浓度为0.2 μg/mL,抗体最佳工作浓度为1∶ 10 000。

2.2 竞争ELISA反应条件的优化

通过实验数据对比,确定优化后的反应条件为包被条件采用4 ℃过夜方式；包被缓冲液选择0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液(pH 9.6)；最佳竞争反应时间为0.5 h；显色反应时间为15 min。

2.3 竞争反应条件优化后的ELISA标准曲线

图2 优化后的竞争ELISA标准曲线Fig.2 Standard curve of competitive ELISA after optimization

2.4 准确度(添加回收实验)

考察磺胺嘧啶在猪尿液、牛奶和猪肉中添加回收实验，结果见表1。由表1可知：猪尿样品的添加回收率在75.7%～84.8%，批内变异系数CV 为1.9%～8.3%，批间变异系数CV 2.5%～9.7%。牛奶样品的添加回收率为81.5%～89.7%，变异系数CV 为2.8%～8.6%。猪肉样品添加回收率为74.4%～82.3%，变异系数CV为3.7%～8.1%。

表1 针对不同样本的SD添加回收实验

2.5 特异性实验

通过竞争ELISA方法测定磺胺嘧啶与磺胺喹恶啉、磺胺二甲嘧和磺胺异恶唑的IC50及交叉反应率，结果见表2。由表2可知：该ELISA试剂盒除与磺胺二甲嘧啶有一定的交叉反应之外，与磺胺喹恶啉、磺胺异恶啉和磺胺吡啶的交叉反应率均低于1.5%。

表2 交叉反应率的测定

2.6 稳定性实验

为了确定试验盒的稳定性，将试剂盒在4 ℃条件下，放置0、30、90和180 d后测定SD的回收率和CV值，结果见表3。由表3可知：实验期间不同时间牛奶样品添加回收试验的综合回收率差异不显著，批内变异系数CV均未超过10%。

表3 保存试剂盒一段时间后的SD添加回收实验

3 结论

本研究建立SD的ELISA方法，其检测灵敏度、特异性、检测范围、精密度、准确度和稳定性不仅可以满足食品原料和成品中SD含量的检测，还能满足目前国家对SD限量要求的分析，且SD ELISA批内变异系数小于10%，批间小于15%都可以满足国家对SD限量要求的分析。磺胺类药物具有的对氨基苯磺酰胺结构特征，导致SD ELISA与其他磺胺类药物有一定的交叉反应率，但本实验的研究结果大多属于可以接受的范围，因此对国家限量检测磺胺类药物无明显的影响，测定方法的稳定性可以满足试剂盒的要求。尤其重要的是，本研究通过对常见食品添加回收的数据分析显示建立的SD ELISA对样品分析的适用度宽，可以满足HPLC样品的筛选和现场检查的要求。

[1] 赵书景,贺绍君,罗国琦，等.动物性食品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医，2009，36(8)：60-63.

[2] 陈敏燕,孙涛,王香敏.兽药残留及其危害[J].动物医学进展,2005,26(10)：111-113.

[3] 王曼霞,林黎明,邱芳,等.高效液相色谱法测定动物组织中磺胺类残留量[J].分析化学,2004,32(11)：1421-1425.

[4] 赵丕成,袁大为,祝润,等.抗磺胺嘧啶单克隆抗体的制备及其ELISA检测试剂盒的建立[J].细胞与分子免疫学杂志,2004,20(2)：191-194.

[5] 关嵘,顾鸣,魏万贵,等.酶联免疫法检测动物组织中磺胺嘧啶残留方法的建立[J].检验检疫科学,2004,14(1)：9-11.

[6] 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法[M].北京:北京人民军医出版社,2000.

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(责任编辑 周晓薇)

Determination of sulfadiazine in the veterinary drugs residue by sensitive ELISA

TIAN Bo1,2,JIN Jian1,HUI Renjie1,XU Fenglian2,WU Tao2,LI Wei2

(1. School of Pharmaceutical Sciences,Jiangnan University,Wuxi 214122，China; 2. Wuxi Tongxin Biotechnology Co. Ltd.,Wuxi 214028，China)

Using indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),a rapid,highly selective and extremely sensitive method has been established for the determination of sulfadiazine (SD).The SD detection limit was 0.213 ng/mL for indirect competitive ELISA formats,the assay ranges from 1.84 to 57.41 ng/mL,except for the cross reactivity with sulfadimidine is over 10%, cross reaction with other sulfadrugs were low than 1.5%, and there was no significant change under 4 ℃ in 180 d.The within-run and between-run CVs of the SD-ELISA were less than 10% and 15%,respectively.The mean recoveries from the SD-free pig urine,milk and pork were 75% to 90%.The results show that the SD-ELISA method can be applied to detect the SD contamination in food and animal feed.

sulfadiazine; indirect competitve ELISA; recovery test; cross-reaction rate

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.011

2014-03-13

江苏省自然科学基金青年项目(BK20140136)

田 博(1987—)，男，吉林农安人，研究方向：药物分析;金 坚(联系人)，教授，E-mail：jianjin@jiangnan.edu.cn

TS201

A

1672-3678(2017)01-0069-04