微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化

施 昶，黄海飞，李梦园，沈诗偲，韩 伟,2

(1.华东理工大学药学院中药现代化工程中心，上海200237； 2.上海市新药设计重点实验室，上海200237)



微波提取山楂中黄酮类化合物的工艺优化

施 昶1，黄海飞1，李梦园1，沈诗偲1，韩 伟1,2

(1.华东理工大学药学院中药现代化工程中心，上海200237； 2.上海市新药设计重点实验室，上海200237)

以总黄酮得率为指标，采用微波法辅助提取山楂叶中的总黄酮，选取浸提时间、乙醇体积分数、微波辐射时间、液固比等参数进行单因素试验，选择影响较大的因素，利用Design-Expert 8.0.5b进行响应面分析，得到优化的提取工艺条件：乙醇体积分数56%，液固比51 mL/g，微波辐射时间3.7 min，在此条件下，山楂叶中总黄酮得率为8.923%。

微波提取；山楂叶；总黄酮；响应面分析

山楂叶为蔷薇科植物山里红(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br)或山楂(GrataeguspinnatifidaBge.)的干燥叶[1]，主要用于理气通脉、活血化瘀。它的有效活性化学成分主要有三萜和黄酮两大类，目前对黄酮类成分研究较多[2]。黄酮类成分在降血压、调血脂、增大心脏血流量和清除体内自由基等方面疗效显著[3]。山楂叶与山楂果实的营养及药用成分非常相近，但其黄酮类化合物的含量高达2%，为果实含量的20～120倍[4]。

山楂总黄酮常见的提取方法有水提取法[5]、超声波法[6]和醇浸提法[7]等，这些方法在不同程度上存在提取不完全、操作繁琐、耗时过长、设备复杂等缺陷。微波法是一项新型提取技术，具有选择性强、加热均匀、快速高效、绿色节能等特点。

本文以总黄酮得率为指标，采用微波法辅助提取山楂叶中的黄酮类化合物，在单因素试验的基础上进行方差分析，并通过Box-Behnken中心组合试验设计(BBD)——响应面法优化工艺条件，以期为山楂叶的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂叶，产自广西桂林；芦丁标准品，含量>98%，中国药品生物制品检定所；乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH(分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司；去离子水，上海华震科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GYFS06型多功能粉碎机，江西赣云食品机械有限公司；UV1900PC型紫外-可见分光光度计，上海亚研电子科技有限公司；AL104型分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；ER-692型微波炉(输出功率为650 W，频率为2 450 MHz)，中国电子器件工业总公司；SHZ-DIII型循环水式多用真空泵，上海予华仪器设备有限公司；电热鼓风恒温干燥箱，上虞市沪南电炉烘箱厂。

1.3 实验方法

1.3.1 总黄酮的测定

1)芦丁标准溶液的配制。精确称取已干燥至恒质量的芦丁标准品9.8 mg，用适量无水乙醇将其溶解，待其充分溶解后转移至50 mL容量瓶中，定容、摇匀，得到质量浓度为0.196 mg/mL的芦丁标准对照品溶液。

2)最大吸收波长的测定。量取2 mL已配好的芦丁标准溶液，置于25 mL容量瓶中，加入质量分数为5%的NaNO2溶液1 mL，静置6 min；再加入1 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液，静置6 min；然后加入10 mL质量分数为4%的NaOH溶液，用体积分数30%乙醇溶液定容，摇匀，静置15 min。在400～750 nm范围内，用紫外-可见分光光度计进行波长扫描，测得最大吸收波长为510 nm。

3)标准曲线的绘制。分别取上述芦丁标准溶液1、2、4、6、8和10 mL于6个25 mL容量瓶中，按上述NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法的步骤完成操作后，于510 nm波长处分别进行比色测定，参比为空白试剂。以吸光度A为纵坐标，质量浓度ρ(mg/mL)为横坐标，用最小二乘法作线性回归，得标准曲线回归方程：A=10.14ρ+0.020，R2=0.997。

1.3.2 总黄酮的单因素提取实验

将山楂叶洗净后自然晒干，然后将其用粉碎机粉碎，筛分得到粒度为0.25 mm的山楂叶粗粉，装袋于阴凉处备用。精确称取1 g山楂叶粗粉于锥形瓶中，加入一定液固比(20∶ 1、30∶ 1、40∶ 1、50∶ 1和60∶ 1 mL/g)的乙醇溶液浸泡一段时间(5、10、15、20和25 min)。微波装置由于功率固定，这里采用对时间的调节改变辐射强度，提取一定时间(2、3、4、5和6 min)后，自然冷却，抽滤并洗涤，定容至100 mL容量瓶。摇匀后精密量取已定容的稀释液1 mL于25 mL容量瓶中，在510 nm波长处测定吸光度A。

1.3.3 总黄酮得率的测定

由标准曲线回归方程，按式(1)计算总黄酮的得率。

(1)

式中：ρ为总黄酮的质量浓度(mg/mL)；V为提取液体积(mL)；n为总稀释倍数；m为山楂叶粗粉的质量(g)。

1.3.4 响应面设计实验

在单因素试验基础上，选择对黄酮得率影响较大的因素，采用3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验设计方法，以乙醇体积分数(A)、微波时间(B)、液固比(C)为变量，每个变量分别以-1、0、1表示，进行17个试验点(5个中心点)的二次回归组合设计试验，确定提取的最佳工艺条件，试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

2 结果与讨论

2.1 微波法辅助提取单因素实验

2.1.1 浸提时间的影响

采用微波法辅助提取样品前一般需要将其浸润，浸润是否充分由浸提时间决定。在固定乙醇体积分数为50%、液固比50 mL/g、微波辐射时间3 min时，考察浸提时间对总黄酮得率的影响，结果如图1所示。由图1可知，随着浸提时间的增大，黄酮得率持续上升。但当时间达到15 min后，得率升高速度减缓，说明15 min以后，浸提时间对得率的影响很小。综合考虑时间成本与黄酮得率，选取浸提时间为15 min。

图1 浸提时间对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of dipping time on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.2 乙醇体积分数的影响

一般情况下，增加乙醇的用量可以促进总黄酮的溶解，乙醇体积分数越大，黄酮溶解越充分。在液固比50 mL/g、浸提时间15 min、微波辐射时间3 min的条件下，考察乙醇体积分数对得率的影响，结果见图2。由图2可以看出：在20%～60%时，随着乙醇体积分数的升高，黄酮得率随之升高；乙醇体积分数到达60%以后，得率反而下降。这可能是因为乙醇体积分数过大，会造成混合溶剂极性减小，不利于黄酮的溶解[8]，因此，乙醇体积分数选择为40%～60%。

图2 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.3 液固比的影响

液固比是影响得率的重要因素之一，通常情况下，药材用量固定，改变溶剂的用量。在乙醇体积分数为50%、浸提时间15 min、微波辐射时间3 min的条件下，考察不同液固比对提取的影响，结果见图3。由图3可知：当其他条件不变时，液固比为20～50 mL/g时，黄酮得率随液固比的增加而增大，液固比为50 mL/g时达到最大值，当液固比继续增加时得率反而下降。这主要是因为溶剂用量过大会影响微波辐射的效果，极性较大的溶剂能有效吸收微波能，导致细胞液对微波能的吸收减少，总黄酮不能从细胞中充分溶出[5]，因此，液固比选取为50 mL/g。

图3 液固比对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.1.4 微波辐射时间的影响

微波辐射时间直接影响提取温度，是微波法辅助提取过程的关键。在乙醇体积分数为50%、液固比50 mL/g、浸提时间15 min的条件下，考察微波辐射时间对提取结果的影响，结果如图4所示。由图4可知：当其他条件不变时，随着微波时间的增加，黄酮得率呈现先升高后降低的趋势。这可能是因为微波辐射时间太短，有效成分无法充分溶出；而微波时间过长则会导致溶液因温度过高而暴沸，甚至会破坏有效成分。综上，微波辐射时间选择为3 min。

图4 微波辐射时间对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of radiation time on the yield of total flavonoids from hawthorn leaves

2.2 单因素实验的方差分析

由单因素实验可得，每个因素对黄酮得率的影响程度不同。为了减少BBD响应面优化法的实验次数，提高优化效率，对各因素进行方差分析，结果如表2所示。由表2可知：方差数值越低，则相应黄酮得率的波动幅度越小，表明该因素对黄酮得率的影响越少。

表2 单因素方差分析

从表2可以发现，以黄酮得率为指标，各因素的方差由大到小依次为乙醇体积分数、微波时间、液固比、浸提时间。浸提时间对黄酮得率的影响最小。因此，可以确定影响得率的主要因素为乙醇体积分数、微波时间以及液固比。

2.3 BBD响应面法优化工艺

2.3.1 数学模型的建立与显著性检验

在单因素试验的基础上，选择影响山楂叶中总黄酮得率的主要因素——乙醇体积分数、液固比以及微波辐射时间，以黄酮得率(Y)为响应值，采用Design-Expert 8.0.5b软件对这3个因素进行Box-Behnken的实验设计，以优化提取工艺参数。响应面试验设计及结果见表3，回归模型的方差分析见表4，回归模型的可信度分析见表5。

表3 试验设计及结果

表4 回归模型的方差分析

注：*表示影响显著(P<0.05)； **表示影响极显著(P<0.01)。

表5 回归模型的可信度分析

对表4结果进行多元回归拟合、方差分析及显著性检验，得到各条件编码值的二元回归方程为

Y=8.85+0.096A+0.076B+0.078C+0.052AB-0.045AC-8.500×10-3BC-0.49A2-0.075B2-0.12C2

由表5结果可知：回归模型极显著(P<0.01)，而误差项不显著，说明回归方程与实际情况拟合程度较好，可用此模型对试验进行分析与预测。R2=0.986 9，这说明预测值与实测值之间具有高度的相关性，说明模型能解释0.986 9的响应值变化。显著性检验表明，一次项、交互项、二次项均表现出了显著水平，且各因素对总黄酮得率的影响程度由强到弱依次为乙醇体积分数、液固比、微波时间。

2.3.2 各因素交互作用对总黄酮得率响应面分析

一般情况下，响应面分析中会把其他因素固定在零水平，选取2个交互的因素进行分析。当等高线趋于圆形时，两因素的交互作用较弱，当等高线呈现椭圆形时，两因素的交互作用较强[9]。而响应面可以对比各方向的曲率大小来比较各因素对响应值的影响程度，其直观性主要体现在曲率的变化。

图5 乙醇体积分数及微波辐射时间对黄酮得率的响应面分析Fig.5 Response surface plot analysis of the radiation time and ethanol volume fraction to the yield

图6 乙醇体积分数及液固比对黄酮得率的响应面分析Fig.6 Response surface plot analysis of the liquid-solid ratio and ethanol volume fraction to the yield

图7 微波辐射时间及液固比对黄酮得率的响应面分析Fig.7 Response surface plot analysis of the liquid-solid ratio and radiation time to the yield

根据回归方程可得各因素对黄酮得率影响的等高线及响应面，如图5～7所示。由图5～7可以发现：

1)图5与图6的等高线呈椭圆形，而图7的等高线则更接近圆形的弧度。因此，乙醇体积分数(A)与微波辐射时间(B)之间以及乙醇体积分数(A)与液固比(C)之间的交互作用均比微波辐射时间(B)与液固比(C)之间的交互作用更显著，这与回归模型的方差分析结果相一致。

2)固定液固比为50(mL/g)，比较乙醇体积分数和微波辐射时间对黄酮得率的影响，由图5可以看出，曲率在乙醇体积分数与微波辐射时间的方向上都为先增大后减小；然而，在乙醇体积分数方向上的曲率变化更为明显，曲线更陡，而微波辐射时间方向的曲线则相对平缓，说明乙醇体积分数的影响更加显著，这与图5和图6的响应面、显著性检验的结果以及王婷婷等[10]所阐述的现象相一致。

2.3.3 提取工艺的优化及验证

通过Design-Expert 8.0.5b软件响应面优化得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数56.16%，液固比为51.83 mL/g，微波辐射时间3.70 min。在此条件下，预测可得到总黄酮得率为8.968%。为便于实际实验，将参数修正为乙醇体积分数56%，液固比为51 mL/g，微波辐射时间3.7 min。按照修正后的参数进行验证实验，3次平行实验的总黄酮得率的平均值为8.923%，与理论预测值较为接近，表明本实验所建立的数学模型可行。

3 与其他提取方法的比较

曹乐民等[11]以水提取法研究山楂叶总黄酮的提取工艺，并通过正交试验设计确定采用最优浸提条件(提取时间3 h)所得到的黄酮提取得率为1.038%。

赵永福[12]采用超声辅助法提取山楂叶总黄酮，结合正交试验设计得到优化的工艺条件，超声时间30 min，提取次数2次，提取得率为2.43%。

周海旭等[13]对乙醇浸提法提取山楂总黄酮的工艺条件进行了研究，利用Design-Expert 7软件进行响应面分析试验，得到最佳提取工艺条件下的提取得率为0.744%，提取时间60 min。

通过上述3种方法的比较可以看出，本文采用的微波法辅助提取山楂叶总黄酮的提取效率最高。

4 结论

1)采用微波法辅助提取山楂叶中的总黄酮，首先进行了单因素实验，在4个单因素实验的基础上，选取影响较大的3个因素进行响应面优化设计，得到最佳工艺条件：乙醇体积分数56%，液固比为51 mL/g，微波辐射时间3.7 min。在该条件下，山楂叶中总黄酮的平均得率为8.923%。

2)山楂叶中总黄酮的微波提取工艺操作简便、条件温和、高效节能、安全无污染，与常见的水提取法、超声法辅助提取法以及醇浸提法相比，得率最高，提取时间最短。

[1] 国家中医药管理局.中华本草:第4卷[M].上海:上海科学技术出版社,1999:126.

[2] 宋少江,黄肖霄,周晨晨.山楂叶的化学成分和生物活性研究[C]∥中国药学会.第十一届全国中药和天然药物学术研讨会论文集.沈阳：[s.l.]2011:107.

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[12] 赵永福.超声波辅助提取山楂叶中总黄酮工艺研究[J].安徽农业科学,2012,40(19):10076-10077.

[13] 周海旭,高晗,曲良苗,等.响应面法优化山楂叶中黄酮提取工艺[J].河南农业大学学报,2011,45(6):712-715.

(责任编辑 荀志金)

Optimization of microwave extraction of flavonoids from hawthorn leaves

SHI Chang1,HUANG Haifei1,LI Mengyuan1,SHEN Shisi1,HAN Wei1,2

(1.Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Shanghai Key Laboratory of New Drug Design,Shanghai 200237,China)

The microwave extraction was applied to extract flavonoids from hawthorn leaves, selecting flavonoid yield as indicator.Extraction time,ethanal volume fraction,radiation time,and liquid-solid ratio for single factor experiment were selected.Influencing factors of the extraction yield of total flavonoids were chosen using the Design-Expert 8.0.5b for response surface analysis test.The optimum extracting parameters were as follows:microwave ethanol volume fraction 56%,liquid-solid ratio 51 mL/g,radiation time 3.7 min. Under this condition, the yield of flavonoids from hawthorn leaves was 8.923%.

microwave extraction; hawthorn leaves; total flavonoids; response surface analysis

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.007

2016-05-13

上海市大学生创新创业训练计划(s14036)

施 昶(1994—)，女，浙江德清人，研究方向：中药制药工程；韩 伟(联系人)，教授，E-mail:whan@ecust.edu.cn

Q684； TQ464.1

A

1672-3678(2017)01-0043-06