高聚物型色谱柱在高效液相色谱法中一步分析制备葛根素及大豆苷元的应用

夏 明,刘晓宁,魏荣卿,郑 涛

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏南京211800；2.中国科学院 广州能源研究所，广东广州510640)



高聚物型色谱柱在高效液相色谱法中一步分析制备葛根素及大豆苷元的应用

夏 明1,刘晓宁1,魏荣卿1,郑 涛2

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏南京211800；2.中国科学院 广州能源研究所，广东广州510640)

建立了使用以聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)为基质的高聚物型色谱柱一步分离制备葛根提取液中的葛根素和大豆苷元的方法。采用MKF-RP-HH色谱柱(300 mm×7.8 mm,8 μm)，葛根提取液经70%乙醇溶解稀释，以水(A)和甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，柱温30 ℃。结果表明：葛根提取液中的2种有效成分葛根素和大豆苷元均与杂质达到了较好的分离效果，且柱效大于2 100 N/m，优于常规的C-18硅胶色谱柱(柱效：1 000 N/m)。该高聚物型色谱柱不仅可用于上述分析，还可用作半制备柱制备得葛根素和大豆苷元纯品，葛根素在2～50 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y葛根=1.342 2x-1.018 4，线性相关系数为0.999；大豆苷元在2～20 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y大豆=2.275x+0.869 5，线性相关系数为0.999；葛根素和大豆苷元的纯化得率分别可达95.9%和78.5%。

聚苯乙烯-二乙烯基苯；高聚物型色谱柱；反相高效液相色谱法；葛根素；大豆苷元

葛根是豆科植物野葛、甘葛藤的干燥根，早在《本草纲目》中就有葛根可入药的记载[1]，在现代医学中，较多权威资料如《中药大辞典》等著述，它具有以下药理作用：扩张冠状动脉和脑血管、降血糖血脂、抗脂质过氧化和消除自由基、预防老年痴呆等[1-4]。葛根提取液中的主要有效成分为葛根素和大豆苷元等异黄酮类化合物，纯度较高的异黄酮类化合物更具有药用价值，但各类天然葛根中除了异黄酮类化合物，还含有其他有毒成分[5]。为了得到纯度较高的异黄酮类化合物，葛根素的检测、分离技术得到研发人员的广泛关注。通常分离分析葛根提取液是用反相高效液相色谱法[6]，而其色谱柱多为十八烷基硅烷键合的硅胶填料，该基质填料不耐酸碱、不耐水、易污染、难以清洗和再生[7]，易对样品造成不可逆吸附而拖尾[8]，更难以用于大量制备。高聚物型色谱柱填料的结构聚苯乙烯二乙烯基苯(PS-DVB)，其结构耐酸、碱和耐水，易清洗再生[9]，且无不可逆吸附。特别是在优良溶剂作用下也可抗溶胀，耐40 MPa的压力。文献中多为使用硅胶型色谱柱分离分析葛根提取液，而纯化制备时却更换另类填料及重新优化选择流动相条件，极为繁琐。

因此，笔者选用PS-DVB为基质的高聚物型色谱柱(MKF-RP-HH)对葛根提取液进行分离条件的研究并优化，以期达到更好的分离效果，并可直接应用于纯化制备。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(配备P680 HPLC泵、UVD-170U型可变波长紫外检测器，AT-330柱温箱、8125型进样装置)，美国Dionex公司；PS-DVB高聚物色谱柱(MKF-RP-HH)，南京麦科菲高效分离载体有限公司；葛根提取原液(葛根提取液-Ⅰ)，南京工业大学沼气站；甲醇(色谱纯)，美国TEDIA公司；Milli-Q Plus超纯水仪，Millipore公司；葛根素(批号：YM0510YA14)、大豆苷元(批号：GR-133-131014)，美国Sigma公司。

1.2 液相色谱检测条件

色谱柱：MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)；流动相：A为水，B为甲醇；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流动相在使用前分别用0.45 μm的混合纤维膜和尼龙膜过滤，超声30 min。

1.3 葛根素与大豆苷元的混合对照品溶液、葛根提取液的配制

葛根素(6.25 mg/mL)和大豆苷元(5 mg/mL)混合对照品储备液：精密称取葛根素62.5 mg和大豆苷元50.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

葛根素(0.062 5 mg/mL)与大豆苷元(0.05 mg/mL)的混合对照品溶液：精密量取葛根素(6.25 mg/mL)和大豆苷元(5 mg/mL)混合对照品储备液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用0.45 μm的尼龙滤头过滤，备用。

葛根提取液-Ⅱ：精密量取2.5 mL葛根提取液-Ⅰ，置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度(即稀释4倍)，用0.45 μm的尼龙滤头过滤，备用。

葛根提取液-Ⅲ：精密量取1 mL葛根提取液-Ⅱ，置于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度(即稀释10倍)，用0.45 μm的尼龙滤头过滤，备用。

1.4 标准品储备液及标准品溶液的配制

精密称取葛根素20.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度为2 mg/mL的葛根素标准品溶液。

精密称取大豆苷元20.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度为2 mg/mL的大豆苷元标准品溶液。

精密量取1.25 mL葛根素标准品溶液(2 mg/mL)，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度为50 μg/mL的葛根素标准品储备液。

精密量取1.25 mL大豆苷元标准品溶液(2 mg/mL)，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得质量浓度为50 μg/mL的大豆苷元标准品储备液。

精密量取6.0、4.0、2.0、1.0和0.4 mL葛根素标准品储备液(50 μg/mL)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别制得质量浓度为30、20、10、5和2 μg/mL的葛根素标准品溶液。

精密量取4.0、3.2、2.4、1.6、0.8和0.4 mL大豆苷元标准品储备液(50 μg/mL)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别制得质量浓度为20、16、12、8、4和2 μg/mL的大豆苷元标准品溶液。

1.5 葛根素和大豆苷元的收集和浓缩

高聚物型色谱柱MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)可用作半制备柱纯化制备葛根素和大豆苷元。在液相条件下分离葛根提取液-Ⅱ，手动收集葛根素峰和大豆苷元峰，得到葛根素收集液和大豆苷元收集液。

将葛根素和大豆苷元收集液分别置于55 ℃和45 ℃水浴中，经旋转蒸发仪浓缩，得到葛根素浓缩收集液和大豆苷元浓缩收集液。

2 结果与讨论

2.1 流动相中甲醇含量对葛根提取液分离效果的影响

在文献[6]中，色谱柱为Symmetry C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流动相为甲醇和醋酸水溶液梯度条件洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长为250 nm。虽然待测组分与相邻组分可达到基线分离，理论塔板数仅大于1 000 N/m。葛根提取液是成分复杂的混合物，其中，含有多种含氧杂环、氨基、羧基和醛基等极性基团，宜与硅胶型色谱柱填料中残存的硅羟基发生非特异性吸附。另外，硅胶型色谱柱不耐酸、碱和水，易污染，难清洗和再生[7]，而高聚物型色谱柱填料无残留羟基，无此非特异性吸附，且耐酸、碱和水，易清洗和再生[9]，故先借鉴文献[6]流动相体系，用高聚物型色谱柱测定葛根提取液-Ⅱ，但结果比文献[6]的结果差。这是由于高聚物型色谱柱填料与硅胶型色谱柱填料存在结构差异，其最适流动相也必然有差别，故下文将对适合高聚物型色谱柱分离葛根提取液-Ⅱ的最佳液相条件进行优化。

不同体积分数甲醇含量的等度流动相对葛根提取液-Ⅱ分离的影响见图1。

图1 不同等度甲醇流动相条件下葛根提取液-Ⅱ的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of different methanol gradient of kudzu extraction-Ⅱ

由图1可知，在谱线4中，流动相为90%B时，出峰很快，分别在10 min和16 min处出了两个峰。降低甲醇体积分数至50%时(谱线3)，出峰时间延迟，但分离度增大，即在90%B中，8～15 min处的单峰可被分出多个连续的未分离的峰，说明随着甲醇浓度降低，分离度可改善。谱线2为继续降低甲醇体积分数至40%，除10 min处的一组峰外，其他出峰时间都进一步延迟，分离度进一步增大，分别在10、22和30 min出了3组相互分离的峰。再降低至30%B(谱线1)，10 min处的一组峰仍然存在，而第2个峰延至50 min处，第3个峰70 min时仍未出现，其余各峰出峰时间均随甲醇浓度降低而延迟。甲醇体积分数低至30%时，虽然分离度最好，但出峰速度太慢，因此认为40%B为较好等度条件。

以上述不同等度流动相条件的结果，测定葛根素和大豆苷元的混合物对照品溶液，以确定在不同等度甲醇浓度中葛根素和大豆苷元在提取液-Ⅱ中的归属,结果见图2。

图2 不同甲醇等度条件下葛根提取液-Ⅱ和对照品溶液的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of different methanol gradient of the control and kudzu extraction-Ⅱ

根据文献[10-12]可知，葛根素出峰早于大豆苷元；葛根素在较低甲醇浓度下出峰，大豆苷元在较高甲醇浓度下出峰。故由图2可知，谱线7流动相为90%等度甲醇体积分数时，混合对照品溶液在9 min和15 min各出一个峰，分别为葛根素和大豆苷元。降低甲醇体积分数至50%时(谱线6)，混合对照品溶液只在13 min有一个葛根素峰，而大豆苷元70 min仍未出峰。谱线5中，在40%等度甲醇体积分数下葛根素在20 min出峰，大豆苷元更不出峰。由上述结果可知，葛根素及杂质峰随甲醇浓度降低而推迟出峰；而大豆苷元除在流动相为90%等度甲醇体积分数中出峰，低于50%B在70 min内皆不出峰。

为了使葛根提取液-Ⅱ中成分既有良好的分离度，又使大豆苷元出峰，进一步改进流动相洗脱方式为梯度洗脱，洗脱结果见图3。

a为杂质一；b为葛根素；c为杂质二；d为大豆苷元谱线2为提取液-Ⅱ-40%CH3OH等度谱线8为提取液-Ⅱ-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)谱线9为对照品-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)图3 不同条件洗脱葛根提取液-Ⅱ和对照品的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of kudzu extraction-Ⅱand standard samples by different methanol gradient

由前文可知，在等度40%B条件下，虽然大豆苷元不出峰，但提取液-Ⅱ中各峰出峰时间和分离度较好；另又可知大豆苷元在90%B时可出峰。结合两者，先在等度40%B流动相中洗脱20 min，而后在 20～25 min提升甲醇体积分数至90%B，即谱线8。比较谱线2与谱线8可知，30 min前各峰的分离度在谱线2、8中均相当，即10 min处有一组峰a，22 min处有一尖峰b；当30 min后，谱线8在30～35 min处出了一组峰c，在40 min出了一个独立的尖峰d。以谱线8的流动相条件测定葛根素和大豆苷元混合对照品溶液，即谱线9。由此可知，葛根素和大豆苷元分别在22、40 min出峰，即谱线8中b、d分别是葛根素和大豆苷元，a和c分别为提取液-Ⅱ中的杂质峰。此结果表明，经谱线8条件洗脱后，葛根素和大豆苷元都有出峰，且均与杂质峰达到基线分离。另由前文可知，分离度随甲醇浓度降低而增大，故进一步优化降低0～20 min的等度甲醇浓度，洗脱结果见图4。

a为杂质一；b为葛根素；c为杂质二；d为大豆苷元谱线8为提取液-Ⅱ-40%CH3OH(0～20 min)40→90%CH3OH(20～25 min)谱线10为提取液-Ⅱ-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～40 min)谱线11为提取液-Ⅱ-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～45 min)谱线12为对照品-35%CH3OH(0～35 min)35→90%CH3OH(35～45 min)图4 不同条件洗脱葛根提取液-Ⅱ的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of kudzu extraction-Ⅱ by different methanol gradient

由前图1可知：葛根素在等度40%B、30%B流动相中分别在22 min和50 min出峰，可推测，若在等度35%B流动相中，葛根素约在35 min出峰。谱线10为先在等度35%B流动相中洗脱35 min，而后在35～40 min提升甲醇体积分数至90%B。对比谱线8与10，10 min的杂质出峰时间仍然不变。谱线10中，葛根素出峰时间延迟至35 min，杂质二延迟至45～50 min，大豆苷元延迟至55 min，葛根素峰与杂质一分离度增大至4.5，谱线8、10中，大豆苷元与杂质二的分离度相当。

为制备纯净的葛根素和大豆苷元，需增加大豆苷元与杂质二的分离度。根据大豆苷元在低浓度下不出峰，可推测，减缓提升甲醇浓度的速率，从而延迟大豆苷元出峰，达此目的。谱线11为先在等度35%B流动相中洗脱35 min，而后再在35～45 min提升甲醇体积分数至90%B。由谱线10与11比较可知，两者葛根素峰与杂质一分离度相当，均大于等于4.5，且谱线11中大豆苷元峰与杂质二的分离度由5.1增至7.8，至此，为纯化制备建立了较可靠的谱线基础。

2.2 半制备柱收集葛根素和大豆苷元

高聚物型色谱柱MKF-RP-HH(300 mm×7.8 mm，8 μm)可用作半制备柱一步纯化制备葛根素和大豆苷元。通过对葛根素和大豆苷元收集液浓缩后的再测定，可评价纯化制备的效果。

2.2.1 葛根素和大豆苷元的定性

用半制备柱在谱线11条件下分别测定葛根素、大豆苷元的收集液和浓缩收集液，结果见图5。

a为杂质一；b为葛根素；c为杂质二；d为大豆苷元；e为流动相所出峰图5 各样品在谱线11条件下洗脱的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of condition 11 gradient of samples

由图5可知：在流动相空白中，56 min处出现峰e，此峰为流动相梯度改变所出；而混合对照品除流动相空白峰e外，33 min处峰b和60 min处峰d分别为葛根素和大豆苷元；与图5(a)葛根提取液-Ⅱ比较，葛根素收集液和其浓缩收集液则在33 min处出葛根素峰b，而无杂质峰a、c，即其中无杂质一和杂质二，说明该收集液为葛根素纯品，即此收集过程已一步达到了对葛根素的分离纯化。另两峰面积的大小则是因浓度不同，即浓缩收集液中的峰b面积大于收集液；同样，大豆苷元收集液和浓缩收集液中除峰e外，只有峰d，其面积的大小也说明此收集过程已一步且同时达到了对大豆苷元的分离纯化及浓缩。

2.2.2 标准曲线绘制

按谱线11条件测定葛根素及大豆苷元标准品溶液，其葛根素、大豆苷元峰面积分别见表1、2。

表1 不同浓度葛根素标准品的峰面积

表2 不同浓度大豆苷元标准品的峰面积

由表1和表2可知：由峰面积y对浓度x回归,得其线性相关系数R2，用加权法处理得到葛根素的回归方程y葛根=1.342 2x葛根-1.018 4,R2=0.999在2～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好；大豆苷元的回归方程y大豆=2.275x大豆+0.869 5,R2=0.999，在2～20 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2.3 收集液中葛根素和大豆苷元得率的考察

以谱线11条件分离葛根提取液-Ⅱ并收集葛根素和大豆苷元。单次分别收集葛根素及大豆苷元收集液9和2 mL，重复4次(共进样80 μL)并合并其收集液，经旋蒸浓缩，得到葛根素浓缩收集液5 mL，大豆苷元浓缩收集液0.15 mL。

用谱线11条件对葛根提取液-Ⅲ和葛根素浓缩收集液进行高效液相色谱测定，两者的葛根素峰面积分别为71.517和10.118，由葛根素标准曲线的回归方程可知：

葛根提取液-Ⅲ中葛根素质量浓度为54.04 μg/mL，则葛根素提取液-Ⅱ中葛根素质量浓度为540.4 μg/mL。

4次/80 μL葛根提取液-Ⅱ中葛根素量为540.4 μg/mL×(80/1 000) mL=43.23 μg；葛根素浓缩收集液中葛根素质量浓度为8.30 μg/mL，5 mL葛根素浓缩收集液中葛根素量：8.30 μg/mL×5 mL=41.50 μg。葛根素收集得率：(41.50 μg/43.23 μg)×100%=95.9%。

用谱线11条件对葛根提取液-Ⅱ和大豆苷元浓缩收集液进行HPLC测定，两者的大豆苷元峰面积分别为34.755和15.033,由大豆苷元标准曲线的回归方程可知葛根提取液-Ⅱ中大豆苷元质量浓度为14.89 μg/mL，4次/80 μL葛根提取液-Ⅱ中大豆苷元总量：14.89 μg/mL×(80/1000) mL=1.191 2 μg；大豆苷元浓缩收集液中大豆苷元质量浓度为6.23 μg/mL，0.15 mL大豆苷元浓缩收集液中大豆苷元含量：6.23 μg/mL×0.15 mL=0.934 5 μg，故收集大豆苷元得率为(0.934 5 μg/1.191 2 μg)×100%=78.5%。

由上可知，用MKF-RP-HH高聚物色谱柱对葛根提取液-Ⅱ中的葛根素和大豆苷元进行一步法分离纯化和半制备，其得率分别可达95.9%和78.5%。

3 结论

以PS-DVB高聚物填料装填的半制备型色谱柱为研究对象，对葛根提取液-Ⅱ中的葛根素和大豆苷元进行一步分离纯化和半制备。色谱检测条件：色谱柱规格为(300 mm×7.8 mm，8 μm)，流动相为甲醇和水，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃，使用分段梯度法洗脱(35% CH3OH(0～35 min)35→90% CH3OH(35～45 min))可将葛根素、大豆苷元与杂质达到有效分离并收集得葛根素和大豆苷元纯品。在该检测条件下可以实现对葛根素和大豆苷元的一般检测，并一步得到葛根素和大豆苷元纯品，葛根素在2～50 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y葛根=1.342 2x-1.018 4，线性相关系数为0.999；大豆苷元在2～20 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为y大豆=2.275x+0.869 5，线性相关系数为0.999。

综上所述，本实验采用高PS-DVB聚合物色谱柱一步分离纯化和半制备葛根素和大豆苷元，方法简单，葛根素和大豆苷元的得率分别可达95.9%和78.5%，为制备葛根素和大豆苷元纯品提供了新方法。

[1] 苏春晖.临证巧用葛根[J].中医杂志,1999,40(3):135.

[2] CHANG B Y,LEE D S,LEE J K,et al.Protective activity of kudzu (Puerariathunbergiana) vine on chemically-induced hepatotoxicity:in vitro and in vivo studies[J].BMC Complem Altern Med,2016,16:39.

[3] SHIH C H,CHANG T Y,KO W C.Interaction between daidzein and hesperetin on antispasmodic action in isolated sensitized and non-sensitized guinea-pig tracheas[J].Front Pharmacol,2016,7:75.doi:10.3389/fphar.2016.00075.

[4] LIU X C,MO Y Z; GONG J B,et al.Puerarin ameliorates cognitive deficits in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Metab Brain Dis,2016,31 (2):417-423.

[5] WANG D Y,QIU L W,WU X L,et al.Evaluation of kudzu root extract-induced hepatotoxicity[J].J Ethnopharmacol,2015,176:321-326.

[6] 金文姗,谈钰元,陈有根,等.高效液相色谱法测定不同产地葛根中葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量[J].中国中药杂志,2003,28(1):49-51.

[7] SYCHOV C S,ILYIN M M,DAVANKOV V A,et al.Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high-performance liquid chromato-graphy[J].J Chromatogr A,2004,1030(1/2):17-24.

[8] 魏荣卿,杨洋,张婷婷,等.国产氢型阳离子交换(磺酸型)HPLC色谱柱在利巴韦林注射液分析中的应用-I[J].离子交换与吸附,2007,23(2):119-128.

[9] LLOYD L L.Rigid macroporous copolymers as stationary phases in high-performance liquid-chromatography[J].J Chromatogr A,1991,544(1/2):201-217.

[10] 周红英,王建华,闫凤云.RP-HPLC分离测定甘葛藤茎叶中葛根素、大豆苷和大豆苷元的含量[J].中国中药杂志,2007,32(10):937-939.

[11] WU S,XU W,WANG F R,et al.Study of the biotransformation of Tongmai Formula by human intestinal flora and its intestinal permeability across the Caco-2 cell monolayer[J].Molecules,2015,20(10):18704-18716.

[12] WANG Y J,WANG N,WU L,et al.Simultaneous determination of four components in Baige capsule by HPLC:application to pharmacokinetics and tissue distribution of normal and middle cerebral artery occlusion rats[J].Biomed Chromatogr,2014,28 (4):541-547.

(责任编辑 荀志金)

One-step determination and preparation ofpuerarin and daidzein by polymer column in HPLC

XIA Ming1,LIU Xiaoning1,WEI Rongqing1,ZHENG Tao2

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 2.Guangzhou Institute of Energy Conversion,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,China)

Polymeric chromatographic column with polystyrene-divinyl-benzene(PS-DVB) packing materials (MKF-RP-HH,300 mm×7.8 mm,8 μm) was established to determinate and prepare puerarin and daidzein.The kudzu extraction dissolved and diluted by 70% ethanol.Water (A)/methanol (B) was served as mobile phase at the rate of 1.0 mL/min.Detection was done at the wavelength of 250 nm at 30 ℃.Two active ingredients (puerarin and daidzein) and impurities have achieved effective separation.Column efficiency reached 2 100 N/m that is superior than conventional silica column (1 000 N/m).This polymeric column can be used as semi-preparative column to prepare puerarin and daidzein.The selected chromatographic conditions led to effectively determinating puerarin with good linearity within 2-50 μg/mL,the regression equation wasy(puerarin) =1.342 2x-1.018 4,and the regression coefficient was 0.999; the selected chromatographic conditions were found to effectively determinate daidzein with good linearity within 2-20 μg/mL,the regression equation wasy(daidzein)=2.275x+0.869 5,and the regression coefficient was 0.999.The purification efficiency of puerain and daidzein could reach to 95.9% and 78.5%.

polystyrene-divinyl-benzene;polymeric chromatographic column;reversed phase high-performance liquid chromatography; puerarin; daidzein

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.006

2016-04-26

国家重点基础研究发展计划(973计划)(2013CB733504)；国家高技术研究发展计划(863计划)(2012AA021203)

夏 明(1991—)，女，安徽合肥人，研究方向：仪器分析；刘晓宁(联系人)，教授，E-mail：xiaoningliu@163.com

O65；TQ464.1

A

1672-3678(2017)01-0037-06