健脾摄血方对ITP模型小鼠生命体征和脏器指数的影响

朱长乐，何昊，徐玥，郑蕾，孙艳平，张雅月，秦蓓，陈信义*

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

健脾摄血方对ITP模型小鼠生命体征和脏器指数的影响

朱长乐1，何昊2，徐玥2，郑蕾2，孙艳平2，张雅月1，秦蓓2，陈信义2*

(1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

目的：观察健脾摄血方对ITP小鼠生命体征和脏器指数的影响，为临床应用提供支撑。方法：以抗小鼠血小板血清(APS)免疫造模法，建立BALB/c小鼠模型，体内造成ITP小鼠模型，观察强的松、健脾摄血方对ITP小鼠生命体征和胸腺、脾脏指数影响。结果：①各实验组小鼠体质量、体温与空白对照组比较，无统计学意义(P>0.05)。②造模第8天，模型组、强的松组、健脾组小鼠游泳时间与空白对照组比较，有统计学意义(P<0.01)；实验结束后，模型组小鼠游泳时间仍低于空白组(P<0.05)，强的松组、健脾组小鼠游泳时间均有所延长，以健脾摄血效果最佳。③从注射APS第4天开始，模型组、强的松组、健脾摄血组小鼠进食量明显减少，与空白对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)；干预给药第10天、第12天，强的松组模型小鼠进食量增加，与对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)；第16天健脾摄血组小鼠进食量增加，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)。④从注射APS第6天开始，模型组饮水量增加，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)；给药第10天开始，强的松组小鼠饮水量增加，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)，而健脾摄血组小鼠饮水量无明显增加。⑤注射APS后由于免疫效应，模型组脾脏、胸腺明显增大，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)；经强的松干预后，脾脏、胸腺缩小，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.01)。经健脾摄血方干预后，脾脏与模型组比较，无统计学意义(P>0.05)；胸腺具有统计学意义(P<0.01)。结论：①注射APS复制的ITP小鼠模型符合病证结合模型特征。②强的松、健脾摄血方对ITP模型小鼠不耐劳力、食欲不振等脾气虚症状有明显改善效果。

免疫性血小板减少症；健脾益气摄血颗粒；生命体征；脏器指数

“健脾益气摄血方”是北京中医药大学东直门医院陈信义教授、广州中医药大学陈志雄教授等在承担国家973项目过程中，基于“四君子汤”化裁的经验方，临床主要针对“脾不统血”证的免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenic purpuro,ITP)治疗。为在临床研究的同时，探讨治疗ITP效应机制，我们以注射抗血小板血清免疫造模法建立ITP动物模型，在观察健脾摄血方提升ITP模型小鼠外周血小板减少的同时，观察了健脾摄血方对ITP模型小鼠生命体征和脏器指数的影响，为健脾摄血方改善ITP患者临床“脾不统血”症状提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠，80只，雌雄各半，体质量18～22 g，购于第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2014-002，SPF级实验室IVC笼具饲养。豚鼠，50只，雌雄各半，体质量250 g，购于兴平市天瑞实验动物养殖厂，许可证号：SCXK(陕)2012-001，普通环境饲养。

1.2 药物和试剂

健脾益气摄血方(黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草和炙甘草)，由西安星华药物研究所按照新药药学标准制备并提供；完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国)，不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich，美国)，强的松(上海晶纯生化科技股份有限公司)。

1.3 主要仪器

分析电子天平(赛多利斯 BSA224S，德国)，微量高速离心机(长沙湘仪H1650-W，中国)，高速冷冻离心机(Eppendorf 5804R，德国)，全自动动物血液分析仪(普朗XFA6130，中国)，超纯水系统(Millipore Synergy UV，德国)，远程红外线体温计(NC-9900，中国)，电子天平，计时器。

1.4 实验方法

1.4.1 抗小鼠血小板血清(APS)制备

参照相关文献制备抗小鼠血小板血清[1-2]。制备步骤如下：BALB/c小鼠麻醉取抗凝全血，80×g离心10 min，仔细吸取上层富含血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)，500×g离心10 min，沉淀即为血小板。血小板用PBS洗涤2次，重悬，调整浓度至2.5×106/mL，与等量完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂混合作抗原。其中，以含完全福氏佐剂抗原于0周注射豚鼠足掌、背及皮下，共5点，合计1 mL；以含不完全福氏佐剂抗原分别于1、2、4周按上述相同部位与点数注射。第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，离心分离血清，即得豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)。56℃灭活补体，红细胞吸附，最后用生理盐水稀释成1∶4浓度APS备用。

1.4.2 造模与分组给药

实验前从80只小鼠尾静脉取血，用全自动血液分析仪检测血小板数，按计数结果随机分4组，每组20只，分别为空白组、模型组、强的松组、健脾益气摄血方组(健脾摄血组)。分组后，除空白组按100 μL/20 g腹腔注射生理盐水外，其余各组均按100 μL/20 g剂量注射稀释的APS，每天重复注射至实验结束，造模第8天开始给药，各组均按0.2 mL/10 g体积药物灌胃，其中空白组给予生理盐水。

1.4.3 生命体征检测

主要观察指标如下：①体质量、体温：观测时间点为注射APS前、注射后第8天(开始给药)、第12天、第15天，各组小鼠分别称体质量、测体温并记录。②游泳时间：采用小鼠游泳实验验证，水深20 cm，水温保持在(20±0.5)℃，在尾部束2 g砝码，将小鼠分别放入水中游泳，开始记时，当小鼠头部沉入水中3 s不能浮出水面时，捞出小鼠，记录游泳时间。实验前、注射APS第8天、实验结束后各测1次。③进食与饮水量变化：隔日观测并记录每组小鼠平均饮水量和进食量，观察造模后小鼠进食与饮水量变化。

1.4.4 脏器指数检测

给药结束后第2天，称小鼠体质量，麻醉，处死，完整剥离脾脏及胸腺，去除黏附的血液及其它组织，分别称质量并记录，计算脏器指数：脏器指数=脏器(mg)/体质量(g)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 对ITP小鼠体质量的影响

观测时间点分别为注射APS前、注射后第8天(开始给药)、第12天、第15天检测各组小鼠体质量见表1。

表1 实验各组小鼠体质量变化

从表1可以看出，与空白对照组比较，各实验组小鼠体质量无统计学意义(P>0.05)；实验各组间比较，无统计学意义(P>0.05)。

2.2 对ITP小鼠体温的影响

观测时间点分别为注射APS前、注射后第8天(开始给药当天)、第12天、第15天检测各组小鼠体温见表2。

表2 实验各组小鼠体温变化(℃，

从表2可以看出，与空白对照组比较，各实验组小鼠体温无统计学意义(P>0.05)；实验各组间比较，无统计学意义(P>0.05)。

2.3 对ITP小鼠游泳时间影响

记录小鼠开始游泳至体力耗竭的时间，实验前、造模8天、实验结束后各测1次。各时间点ITP模型小鼠游泳时间检测数值见表3。

表3 实验各组小鼠疲劳程度变化

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，△P<0.05

从表3可以看出：①实验前，各组间小鼠游泳时间比较，无统计学意义(P>0.05)。②造模第8天，模型组、强的松组、健脾组小鼠游泳时间与空白对照组比较，有统计学意义(P<0.01)。③实验结束后，模型组小鼠游泳时间仍低于空白组，(P<0.05)，强的松组和健脾组小鼠游泳时间均有所延长。其中，健脾组较模型组游泳时间延长具统计学意义(P<0.05)。

2.4 对ITP小鼠进食影响

隔日观测并记录每组小鼠平均进食量变化，结果见表4。

从表4可以看出，从注射APS第4天开始，模型组、强的松组、健脾摄血组小鼠进食量明显减少，与空白对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)；第8天开始干预给药，第10天、第12天，强的松组小鼠进食量增加，与对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)；第16天健脾摄血组小鼠进食量增加，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)，与强的松组比较，无统计学意义(P>0.05)。

2.5 对ITP小鼠饮水量影响

隔日观测并记录每组小鼠平均饮水量变化，结果见表5。

表4 实验各组小鼠进食量变化

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

表5 实验各组小鼠饮水量变化

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

从表5可以看出，模型组从注射APS第6天开始饮水量增加，与同时间空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)；第8天开始干预给药，第10天开始，强的松组小鼠饮水量增加，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)，而健脾摄血组小鼠饮水量无明显增加，与空白组、模型组比较、强的松组比较，无统计学意义(P>0.05)。

2.6 对ITP小鼠胸腺、脾脏指数影响

表6 实验各组小鼠脏器指数变化

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05，△△P<0.01

实验结束后，小鼠称体质量，麻醉后，剥离脾脏及胸腺后精确称重，并计算脾脏及胸腺指数，检测数据见表6，脾脏、胸腺大小见图1,图2。

图1 实验各组小鼠脾脏大小比较A：空白组;B：模型组;C：强的松组;D：健脾摄血组

图2 实验各组小鼠胸腺大小比较A：空白组;B：模型组;C：强的松组;D：健脾摄血组

从表6与图1～2可以看出：①注射APS后由于免疫效应，模型组脾脏、胸腺明显增大，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)。②经强的松干预后，脾脏、胸腺均有缩小，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.01)。经健脾摄血方干预后，脾脏与模型组比较，无统计学意义(P>0.05)；胸腺具有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

免疫性血小板减少症(ITP)是临床常见的血液系统自身免疫性疾病，其主要特征是患者体内存在有抗血小板自身抗体而导致血小板破坏增多[3-4]。目前，治疗主要依赖糖皮质类激素，虽然近期疗效较好，但远期疗效并不理想，而且不良反应也大，如向心性肥胖、水钠潴留，还可以并发高血压、糖尿病等[5]。中医药治疗虽然提升外周血小板数值较慢，但能明显改善患者临床症状，巩固治疗疗效比较稳定,因而能够被广大患者所接受[6-9]。

临床观察发现，多数ITP患者发病因袭，进展缓慢，临床以持续性外周血血小板减少，反复发作的慢性出血为特征，且多数患者伴有体倦乏力、神疲懒言、食欲不振、食后腹胀；舌体胖大，边有齿印，舌淡；脉象细弱等[3]。可以看出ITP是最能体现“脾主统血”病理表征的现代医学疾病。

健脾摄血方由《太平惠民和剂局方》的四君子汤加黄芪、阿胶、茜草，并以党参易人参组成。炙黄芪甘，微温，归脾肺经，具有补气、养血、益中功效，在方中为君药。党参甘、平，归脾、肺经，补中益气，生津养血；白术甘，苦归脾胃经，健脾益气；阿胶性平，味甘，归肝、肺、肾经，补血，止血，滋阴润燥；茯苓甘淡，健脾渗湿；茜草苦，寒，归肝经，凉血止血，活血祛瘀。五药合用有加强黄芪健脾益气、养血之功，在方中为臣药。其中，党参、白术、茯苓配黄芪健脾益气，以治疗脾胃虚弱症状；阿胶、茜草配黄芪可益气生血，摄血止血与养血，且止血而不留瘀，并能归经。炙甘草甘温，益气和中，调和诸药，在方中为使药。统揽全方具有健脾益气、摄血养血之效，可用于反复慢性出血，伴有体倦乏力、神疲懒言、食欲不振、食后腹胀；舌体胖大，边有齿印，舌淡；脉象细弱的“脾不统血”证治疗。

在本项研究中，我们采用抗小鼠血小板血清(APS)的免疫造模法建立了ITP小鼠模型，并以强的松，健脾摄血方为干预药物，在探讨健脾摄血方提升ITP小鼠外周血小板数值基础上，观察该方对ITP小鼠体质量、体温、游泳时间、进食与饮水量以及脾脏、胸腺大小的影响，试图探讨该方改善症状疗效，为进一步的临床研究与新药研发提供依据。研究结果显示：①各实验组小鼠体质量、体温与空白对照组比较，无统计学意义(P>0.05)。②造模第8天，模型组、强的松组、健脾组小鼠游泳时间与空白对照组比较，有统计学意义(P<0.01)，表明ITP模型小鼠具有不耐劳力的“气虚”特征；实验结束后，模型组小鼠游泳时间仍低于空白组(P<0.05)，强的松组、健脾组小鼠游泳时间均有所延长，以健脾摄血效果最佳。③从注射APS第4天开始，模型组、强的松组、健脾摄血组小鼠进食量明显减少，与空白对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)，表明ITP模型小鼠存在着食欲减退的“脾虚”特征；干预给药第10天、第12天，强的松组小鼠进食量增加，与对照组比较，具有统计学意义(P<0.05)；第16天健脾摄血组小鼠进食量增加，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.05)，与强的松组比较，无统计学意义(P>0.05)。④从注射APS第6天开始，模型组饮水量增加，与同时间空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)；给药第10天开始，强的松组小鼠饮水量增加，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)，而健脾摄血组小鼠饮食量无明显增加。⑤注射APS后由于免疫效应，模型组脾脏、胸腺明显增大，与空白组比较，具有统计学意义(P<0.05)；经强的松干预后，脾脏、胸腺均有缩小，与模型组比较，具有统计学意义(P<0.01)。经健脾摄血方干预后，脾脏与模型组比较，无统计学意义(P>0.05)；胸腺具有统计学意义(P<0.01)。

基于上述研究结果，结合ITP模型具有皮肤出血特征，可以说明以下问题：①注射APS复制的ITP小鼠模型具有游泳时间延长、饮食量下降、皮肤出血等表现，与中医的脾气虚弱，脾不统血证候基本一致，表明以免疫法复制的ITP动物模型符合病证结合模型特征。②经强的松、健脾摄血方干预后，游泳时间延长、小鼠饮食量增加，表明强的松、健脾摄血方均能改善脾气虚症状，二者之间并无明显差异。至少说明健脾摄血方疗效与强的松相当。③注射APS后，脾脏与胸腺增大是免疫反应的重要特征，而经强的松干预后，脾脏、胸腺有较大幅度回缩，健脾摄血方回缩幅度较小。说明两种干预药物对免疫机制均有调节效应。但由于动物实验的局限性，很难观察到强的松与健脾摄血方之间的明显疗效差异，有待进一步研究。

[1] 富琦,范颖,王家辉,等.免疫性血小板减少性紫癜病证结合动物模型建立与评价[J].中国中医基础医学杂志,2004,10(2):30-32.

[2] 吴晓勇,李冬云,陈信义,等.益髓颗粒对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠细胞相关因子表达影响[J].中华中医药杂志,2010,25(6):849-852.

[3] 陈朴,季丽莉,程韵枫,等.抗原模拟法构建的免疫性血小板减少症小鼠模型中巨核细胞形态学及超微结构的研究[J].中国临床医学,2013,20(4):437-439.

[4] 孙凤,倪虹,郝晶.紫茜合剂治疗慢性原发免疫性血小板减少症的临床观察[J].中医药信息,2016,33(1):95-97.

[5] 刘朝霞.中药复方对ITP模型小鼠细胞因子及Bcl-2、TPO含量的影响[D].济南：山东中医药大学,2013.

[6] 李天天,褚雨霆,刘庆,等.中医药治疗免疫性血小板减少性紫癜优势与问题分析[J].辽宁中医杂志,2015,42(1):9-11.

[7] 王兆钺.免疫性血小板减少性紫癜的发病机制与临床研究进展[J].中国免疫学杂志,2009,25(12):1141-1144.

[8] 郑雪倩,周韶虹,胡明辉,等.健脾滋肾泻火中药联合小剂量泼尼松治疗慢性免疫性血小板减少症的临床研究[J].中医药信息,2016,33(6):59-61.

[9] 文鸿光,文焕琛.加味八珍汤联合小剂量醋酸泼尼松片治疗特发性血小板减少性紫癜临床研究[J].中医药信息,2015,32(1):82-86.

Effect of Jianpi Shexue Prescription on the Vital Signsand Organ Index of ITP Mice Models*

ZHU Chang-le1, HE Hao2, XU Yue2, ZHENG Lei2, SUN Yan-ping2， ZHANG Ya-yue1,QIN Bei2,CHEN Xin-yi2

(1.DongzhimenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedcine,Beijing100700,China；2.SchoolofPharmaceuticalSciences,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China)

Objective: To investigate the effect of Jianpi Shexue prescription on the vital signs and organ index of ITP mice models, providing support for clinical application. Methods: The ITP models of BALB/c mice were established by injection of the anti-platelet serum (APS). Prednisone and Jianpi Shexue prescription were given,and then the changes of vital signs, the spleen and thymus indexes were detected. Results: ①Mice body weight, body temperature had no significant change between the experimental group and control group (P>0.05). ②On the 8th day, the swimming time between control group and ITP, prednisone, Jianpi Shexue prescription group had statistically significant differences (P<0.01); after the experiment, the swimming time of ITP group was still lower than that of the control group (P<0.05), and was prolonged in prednisone group and Jianpi Shexue prescription group, Jianpi Shexue prescription group had the best effect. ③From the 4th day, compared with the control group, the food-intake of ITP group, prednisone group and Jianpi Shexue prescription group was decreased obviously (P<0.05); on the 10th and 12th days, the food-intake of prednisone group was increased significantly compared with that of control group (P<0.05); on the 16th day, the food-intake of Jianpi Shexue prescription group was increased obviously compared with that of ITP group (P<0.05); ④From the 6th day, the water consumption of ITP group was increased markedly compared with that of control group (P<0.05); From the 10th day, the water consumption of prednisone group was increased significantly compared with that of control group (P<0.05); the water consumption of Jianpi Shexue prescription group had no significant difference. ⑤After administration of APS, the volume of spleen and thymus was enlarged obviously compared with that of control group (P<0.05); after administration of prednisone, the volume of spleen and thymus was reduced markedly compared with that of ITP group (P<0.01); the volume of spleen had no significant difference (P>0.05) and thymus was changed significantly in Jianpi Shexue prescription group (P<0.01). Conclusion: ①The ITP model was consistent with the characteristics of the syndrome model. ②Prednisone and Jianpi Shexue prescription can effectively improve the symptoms of easy fatigue, loss of appetite and other symptoms of spleen Qi deficiency.

Immune thrombocytopenic purpura; Jianpi Yiqi Shexue granules; Vital signs; Organ index

2016-04-12

2016-10-11

国家重点基础研究发展计划(973计划)课题(2013CB531705)

朱长乐(1990-)，女，硕士研究生,研究方向：中西医结合治疗血液病。

*通讯作者：陈信义(1954-)，男，教授，主任医师,研究方向：中西医结合防治血液、肿瘤疾病。

R285.5

A

1002-2392(2017)02-0010-05