现时金银花与山银花比较鉴别分析

高珊　郭月秋　刘斯亮

[摘要]目的 对市售金银花与山银花真伪与种类鉴别的方法进行研究同时考察商品质量。方法 采用体视显微、薄层色谱、液一质联用、标识成分（绿原酸、木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙）含量测定等方法对获得的27批样品进行了比较检定。结果 花表面腺毛非腺毛的有无及形态、花萼特征、是否检出灰毡毛忍冬皂苷乙可作为鉴别金银花与山银花的依据；27批样品中，16批为金银花，其中1批掺有加重粉；11批为山银花，其中7批灰毡毛忍冬、2批红腺忍冬、1批华南忍冬、1批黄褐毛忍冬。结论 体视显微特征和薄层色谱法可鉴别金银花与山银花，结合高效液相测定结果实现了对27批样品的质量考察与比较鉴别研究。

[关键词]金银花；山银花；灰毡毛忍冬皂苷乙；体视显微特征；薄层色谱

金银花是我国传统的花类中药材，最早记载在明代的《救荒本草》中，具有清热解毒、疏散风热的功效，作为药食同源品种，在我国种植面积广、品种多，需求量逐年增加，近年出现了金银花与山银花培育新品种，同时也有较多现代加工方法，如烘房烘干、杀青烘干、蒸制干燥、微波干燥等，其商品花蕾较饱满，色泽较绿、表面毛茸少、质地紧实饱满、顶手等特征，掺伪主要为金银花掺加重粉及用“山银花”混充“金银花”。为考察现时金银花和山银花商品质量情况和真伪、种类鉴别，笔者收集了市场流通使用的“金银花”及“山银花”商品27批，采用体视显微特征、薄层色谱法、液一质联用法与高效液相色谱法进行了比较鉴别研究。

1.仪器与试药

CAMAG Scanner-3薄层照相系统（瑞士卡玛公司），OLYMPUS SZ61体视显微镜（日本Olympus公司），Waters e2695/2489高效液相色谱仪（美国Waters公司），Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL（美国Agilent公司），Sartofius BP211D分析天平（德国Sartorius公司），超声波清洗器（上海科导超声仪器公司）。

绿原酸（批号110753-201314）、木犀草苷（批号110720-201402）购自中国食品药品检定研究院，川续断皂苷乙（批号20120330）、灰毡毛忍冬皂苷乙（批号ZM0510BCl3）购自上海源叶生物科技有限公司，27批样品均购于药材市场、药房，甲醇、乙腈为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯，水为超纯水，硅胶G薄层板（青岛谱科分离材料有限公司）。

2.方法与结果

2.1金银花与山银花体视显微特征鉴别

体视显微镜观察27批样品花蕾表面的非腺毛、腺毛、萼筒、萼齿形态，归纳体视显微特征，其中1批样品观察到表面黏附不同程度的白色半透明颗粒状物，为掺加重粉金银花；其余见图1、表1。

2.2薄层色谱鉴别

取供试品粉末1g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lmL使溶解，作为供试品溶液。另取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2uL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6：4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光及紫外光灯（365nm）下检视，见图2。

从图2可以看出，金银花未检出灰毡毛忍冬皂苷乙，山银花中灰毡毛忍冬、红腺忍冬检出灰毡毛忍冬皂苷乙，而黄褐毛忍冬和华南忍冬薄层色谱未检出（与高效液相色谱分析结果一致）。

2.3HPLC-ELSD法含量测定

2.3.1色谱条件 色谱柱：DiamomilC18（4.6mm×250mm，5um），流动相：乙腈（A）-0.4%醋酸溶液（B）梯度洗脱：0～10min，9%A；10～12min，9%A-29%A；12～20min，29%A-33%A；20～25min，33%A-45%A。柱溫：30℃，流速：1.0mL/min。

2.3.2对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙、木犀草苷对照品加50%甲醇分别制成每1ml含绿原酸0.5mg、灰毡毛忍冬皂苷乙0.6mg、川续断皂苷乙0.2mg、木犀草苷0.04mg的混合对照品溶液，色谱顺序见图3。

2.3.3供试品溶液的制备 按《中国药典》2015年版山银花（含量测定）项下供试品溶液制备方法制备。

2.3.4样品测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10uL，按色谱条件测定，见表2。从表中可以看出，金银花与山银花均含有绿原酸和木犀草苷成分，传统与现代加工方法的金银花绿原酸和木犀草苷含量无明显差异；山银花的绿原酸含量除1批华南忍冬未检出、1批黄褐毛忍冬不符合规定外，其余2批红腺忍冬、7批灰毡毛忍冬均高于金银花；金银花木犀草苷含量均符合药典规定（0.050%），山银花相对金银花含量低，但标准未做规定，上述实验结果与文献报道基本一致。金银花不含灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙；山银花中商品来源占绝对优势的灰毡毛忍冬皂苷含量均符合药典规定（5.0%），而市场较为少见的红腺忍冬2批中有1批不符合规定、1批黄褐毛忍冬只检出川续断皂苷乙、1批华南忍冬未检出。

2.4HPLC-MS联用法鉴别

2.4.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（4.6mm×150mm，5um）；流动相同2.3.1；流速：0.8mL/min；柱温：35℃。

2.4.2质谱条件 离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；扫描方式：负离子扫描，采用全扫描一级质谱、选择离子二级质谱（MS/MS）；质荷比范围：50～1500；干燥气温度350℃；干燥气流速：8L/min，雾化器压力：206.7kPa；分流比为1：1。

2.4.3样品溶液的制备 分别吸取2.3项下的对照品、供试品溶液稀释10倍。

2.4.4最低检出限 取对照品溶液以不同比例稀释后测定，信噪比为3时，最低检出限分别为灰毡毛忍冬皂苷乙10ng，川续断皂苷乙2ng。

2.4.5样品测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液1uL，按色谱条件测定，结果见图4。

从图4可以看出，灰毡毛忍冬皂苷乙分子离子[M-H]--m/z1397.7，川续断皂苷乙分子离子[M-N]-m/z10736，忍冬、华南忍冬供试品色谱中均未检出与灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙相同的分子离子峰，灰毡毛忍冬和红腺忍冬供试品色谱中均检出与灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙保留时间相同的分子离子峰，其一、二级质谱均与对照品一致，黄褐毛忍冬检出与川续断皂苷乙保留时间相同的分子离子峰，其一、二级质谱均与对照品一致。

3.讨论

通过药材市场调查，有以山银花伪充金银花及金银花掺加重粉的现象。山银花绝对主流商品为灰毡毛忍冬，其次为红腺忍冬，而华南忍冬和黄褐毛忍冬市场上较难见到。通过观察腺毛、非腺毛及花萼形态等体式显微特征，可以鉴别金银花与山银花、掺加重粉金银花及不同品种山银花，是一种快速、简便、准确的检定方法。根据灰毡毛忍冬皂苷乙成分薄层色谱的检出与否，可以作为金银花与山银花的区别手段之一。但要注意的是未检出灰毡毛忍冬皂苷乙，不要误认为都是金银花（本文收集到的黄褐毛忍冬和华南忍冬样品薄层色谱未检出灰毡毛忍冬皂苷乙），还需结合性状、体视显微特征综合判断。含量测定结果提示：25批样品的绿原酸含量结果均高于药典规定值，由于绿原酸在金银花与山银花的花梗及叶片中廣泛存在，不是其特征性成分，日常监督检验中应注意是否掺有非药用部位及其所占比例的情况。由于黄褐毛忍冬和华南忍冬市场上很难搜集到样品，每种只搜集到一批样品，未能有更多样品数据证实。需要说明的是华南忍冬样品是在花末期采摘的鲜花的干燥品，未检出灰毡毛忍冬皂苷乙是否与花期有关？有待进一步探讨。山银花与金银花功能主治相同、外观性状上较相似，由于山银花价格便宜，有的企业将山银花代替金银花投料，建立的LC-MS联用方法，通过比较供试品色谱中，是否检出与灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙相同保留时间的色谱峰，其一级质谱与二级质谱是否与对照品一致，判断市售含金银花制剂中是否掺山银花投料。

综上所述，鉴别金银花与山银花以及不同种来源山银花时，可根据具体情况选择性状鉴别的同时结合体视显微特征、薄层色谱法及液一质联用法确证，可达到快速准确的目的。