无细胞蛋白表达体系在生物制药工程中的应用

谢典佑

[摘要]作为体外合成蛋白表达手段的一种，无细胞蛋白表达体系有着蛋白合成高效快速、反应操纵简便等方面的优点，在基础生物学领域的研究中有着广泛的应用价值。无细胞蛋白表达体系目前已成功应用于重组蛋白药物的生产。高通量药物筛选等领域，为解决生物制药领域中的难题提供了新的解决思路。同时，经过研究人员的不断努力，对其在生物制药工程中的应用也取得了新的研究进展，显示出重要的应用潜能。本文基于对无细胞蛋白表达体系的阐述和分析，对其在生物制药工程中的应用做出了相关的探讨和研究，以期能为生物制药领域的发展提供一定的技术支撑和借鉴。

[关键词]生物：制药工程；无细胞蛋白；表达体系；应用

随着生物科学技术的发展，人们对蛋白质组学相关的前沿领域的研究越来越关注，无细胞蛋白表达体系（cell-free protein synthesis，CFPS）也因此备受重视。尤其是近些年来，无细胞蛋白表达体系的研究已逐渐从原核深入到真核的反应体系，成本不断降低。较之于传统的体内表达体系，无细胞蛋白表达体系基于细胞提取物，有着不受细胞的生理限制以及胞内蛋白酶的降解、可以在较短的时间内进行大量的毒性蛋白表达、无需繁杂的下游处理以及产物的活性增加等诸多方面的应用优势。同时，其在生物制药中也逐渐体现出了毒性蛋白、复杂蛋白以及膜蛋白表达等方面的优势。但由于天然蛋白水溶性差、半衰期短等因素的影响，如何实现重组蛋白的稳定表达，发挥无细胞蛋白表达体系在医疗方面的应用潜力，就成为生物制药领域的重要研究课题。因此，本文讨论和研究无细胞蛋白表达系统在生物制药工程中的有效应用问题，将对更好地实现该系统在制药科学领域应用潜力的发挥有着重要的理论和现实意义。

1.无细胞蛋白表达体系概述

作为一种生物学技术，传统的蛋白表达是基于细胞体内，对动植物细胞以及细菌等外源基因的表达。而无细胞蛋白合成系统是一种全新的蛋白合成方式，实现了以外源DNA或mRNA为模板，利用细胞抽取物中的蛋白因子、相关的酶系等，通过在体系内加入ATP、GTP以及氨基酸、能量再生物质等来实现蛋白表达的体外系统（如图1所示）。自1982年世界上第一个重组蛋白药物胰岛素问世以来，重组蛋白药物由于来源广泛，且有着较高的安全性在短短几十年时间就实现了在生物制药领域的飞速发展，在全球药物市场上越来越占据着举足轻重的地位。表达重组蛋白药物最常用的系统包括大肠杆菌、釀酒酵母以及中国的仓鼠卵巢细胞。但诸如此类的体内表达系统往往由于种种原因而导致一些复杂蛋白不能顺利表达，在这一迫切需求下，无细胞蛋白表达技术便应运而生。

随着国内外学者对蛋白合成技术的深入研究以及蛋白连续翻译系统的建立，无细胞表达也有了突破性的研究，实现了蛋白的连续表达。该系统无需在活体细胞内进行，基于细胞提取物就可以实现连续的转录和翻译，从而快速高效合成目标蛋白。该系统没有细胞壁，也不必关注维持活体细胞生命的相关生化反应，在表达技术上占据独特的优势。同时，蛋白合成的条件相对容易调整，有助于蛋白的表达和折叠。依据这一优势，无细胞蛋白表达体系在生物制药工程中也较多适用于快速表达医用蛋白、高通量蛋白库筛选等复杂蛋白质的合成。该系统的另一个优势是表达具有毒性的蛋白，由于无需维持宿主细胞的活性，也更容易地实现插入非天然氨基酸的表达，可较好地被用于研究蛋白的化学特性中。因此，随着近些年来对该系统相关应用研究的不断深入，已经逐渐实现了在生物制药相关领域的广泛应用，如进行多肽类药物、肿瘤疫苗、重组蛋白药物等大规模的生产以及高通量药物的筛选等。

2.无细胞蛋白表达体系的分类

就目前来讲，已开发出来的无细胞蛋白表达系统主要包括原核和真核两种表达系统类型。两者由于表达系统的不同，也存在着不同的特点，在实际科学生产研究的过程中需要根据不同的需求进行两种表达系统的恰当选择。

2.1原核系统

对原核表达系统的研究由来已久，该系统实现目标蛋白的表达是利用的原核生物细胞提取物，最为常见的是大肠杆菌。由于其具有较强的耐受性，因此在此基础上建立无细胞蛋白表达系统就具有独特的优势。人们在具体进行目标蛋白的表达中，可以根据需要加入蛋白酶抑制剂以及标记蛋白等特殊添加剂，在含有杂质的情况下依旧可以进行目标蛋白的表达。其不足之处在于在进行蛋白的翻译加工后，在正确折叠方面现阶段仍是较大的困难。不过由于大肠杆菌材料来源广泛，成本较低，也存在着较高的表达效率，因此在体外表达系统研究中仍是较为热门的话题。

2.2真核系统

真核表达系统是与原核表达相对应的系统，其进行目标蛋白的表达，利用的是真核生物细胞提取物。其中，最为常见的就是麦芽提取物和兔网织红细胞裂解液。与上述表达系统不同的是，真核细胞表达系统不存在基因的非特异性激活或者抑制，因此能够实现对调控基因的高效表达。在该表达系统中，为保证得到性质相对稳定的蛋白质，实现真核细胞基因组的整合，也常需要将环状的模板线性化，以保证合成效率不断加强。经过相关学者的实践研究证实了，大肠杆菌以及麦芽提取物系统都有着较高的合成量，能够进行高通量的蛋白质组学研究。

3.在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达体系长时间以来由于生产效率低下、成本高昂等缺点的限制，在生物学领域的研究较广。随着生物技术的进步，相关的能量再生系统以及细胞提取物制备工艺等近些年来逐渐得以深入的研究和不断优化，实现了蛋白的体外高通量表达，并有效拓展了无细胞蛋白表达系统的应用领域。尤其是在生物制药领域，该系统有着重要的应用潜力，为实现生物制药诸多问题的解决提供了新的解决思路。以下是笔者根据自身所学，总结出的无细胞蛋白表达系统在生物制药工程中进行重组蛋白药物的大规模生产、非天然氨基酸的引入以及蛋白的高通量表达等方面的具体应用。

3.1引入非天然氨基酸

进行蛋白工程改性的重要途径就是将非天然氨基酸引入蛋白序列，以为蛋白质进行化学修饰提供额外的基因。在早期的无细胞蛋白表达体系中，通过加入抑制性tRNA以识别特定终止密码子的氨酰化，并以携带特定位点无义突变的基因作为模板，在目标蛋白的特定位点引入非天然氨基酸（见图2）。相关的研究人员在此基础上发现了更为有效的编码非天然氨基酸技术，并成功实现了在蛋白药物进行特异性修饰中的应用，赋予了非天然氨基酸以独特的药理特性，如延长半衰期以及提高了药代动力学稳定性等。在现阶段的研究中，通过在无细胞蛋白表达体系中添加非天然氨基酸底物，建立了高效便捷的反应体系，能够对目标蛋白进行选择性的修饰。如国外研究者Zimmerman等现已研发出新型的抗肿瘤药物等。总之，由于这一方面的优势，该体系在升级蛋白药物领域以及开发新型蛋白药物中有着广阔的应用前景。

3.2重组蛋白药物的大规模生产

随着相关科学家研究的不断深入和优化，近些年来无细胞蛋白表达技术已日趋成熟，能够成功开发出反应时间更长、体积更大且生产效率更高的体外蛋白合成系统。除此以外，无细胞蛋白表达体系的优势还表现在蛋白活性以及下游纯化工艺等方面，推进了在重组蛋白药物生产领域中应用该系统的更深层次的研究和发展。无细胞蛋白表达系统的常用来源为大肠杆菌，除此以外对上述的真核系统为来源的表达体系也逐渐被得以进一步开发，在更加复杂结构的膜蛋白以及翻译后的修饰中得以开发生产。在这一方面国外学者Brodel等有了新的研究进展，其建立了一套新型的哺乳动物无细胞蛋白表达体系，在促进蛋白正确折叠、表达复杂蛋白方面占据着优势地位。并且在这一系统下，他们已实现了在体外进行人促红细胞生成素和萤火虫荧光素酶的成功表达，并实现了对其进行糖基化修饰，有着里程碑的研究意义。其研究结果也证实了，无细胞蛋白表达技术在重组蛋白药物中，有着较好的大规模生產的应用前景。

3.3蛋白的高通量表达

实现基因编码的蛋白质之间的相互作用关系以及结构功能的系统阐明，成为后基因组时代科学家面临的重大难题之一。在这一背景下，建立相对高效的高通量蛋白表达技术就有着十分重要的现实意义。而无细胞蛋白表达体系由于其自身独特的优势，在近些年来的科学研究中倍受青睐。较之传统的体内表达体系，无细胞蛋白表达体系省去了对分子的克隆过程，可直接使用PCR片段作为模板。对于一些很难在体内进行系统表达的复杂蛋白，也能够实现在无细胞蛋白表达系统中的正确折叠。利用这些优势，研究人员在进行体外蛋白质组学的研究过程中，就有了一个更加灵活的研究手段。除此以外，该系统的优势还在于能够进行高效便捷的制备蛋白芯片。利用无细胞蛋白表达体系能够一步法实现蛋白的固定化，无需在进行大量可溶性蛋白的纯化，从而省去了高昂的成本费用以及蛋白的表达与纯化过程，有着较为灵活的过程和特点。现阶段经过大量的实验研究，蛋白芯片技术已逐渐能够在临床诊断以及对有毒物质的检测中进行有效地应用，如对代谢类疾病、癌症以及免疫的诊断等。总之，无细胞蛋白表达体系在蛋白制备技术以及高通量蛋白表达中的成功应用和快速发展，也促进了其在新药发现、疫苗研发以及疾病诊断等诸多领域的广泛应用。

综上所述，作为一种快速高效的体外蛋白合成手段，无细胞蛋白表达体系较之传统的体内表达，能够有效弥补其不足，实现了复杂蛋白在体外的顺利表达，因此在生物制药领域中有着广阔的应用前景。当然，在现阶段的无细胞蛋白表达体系中的研究中也仍然存在一定的不足之处，要实现其在生物制药工程中更为广泛的应用，还需要相关的研究人员不断优化和研究其反应体系，充分挖掘体外合成系统的应用潜力，更好地推进我国生物制药工程的发展。