2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鉴别

龚甜，张艳妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鉴别

龚甜，张艳妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病预防控制中心，江西南昌330029)

目的运用逆转录多聚酶链式反应-限制性片段长度多态性分析方法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR-RFLP)快速鉴别2015年麻疹疫苗株病毒。方法用RT-PCR-RFLP方法检测两例疑似疫苗相关麻疹病例咽拭子标本是否含有AflⅡ酶切位点鉴别麻疹疫苗株病毒，同时对标本进行N基因羧基末端450个核苷酸进行序列测定分析，在基因层面进一步证实，以验证RT-PCR-RFLP方法。结果RT-PCR-RFLP方法鉴定的结果为两例疑似疫苗相关麻疹病例咽拭子标本均能被AflⅡ酶切开，N基因序列测定结果为两例疑似疫苗相关麻疹病例咽拭子标本为麻疹疫苗株病毒A基因型。结论首次为江西省麻疹疫苗株病毒提供实验室证据。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆转录多聚酶链式反应；限制性片段长度多态性分析方法

麻疹是一种具有高度传染性的急性发热出疹性疾病，是疫苗可预防的传染病[1-3]，通过进行含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）免疫接种，麻疹可以得到很成功的控制[4-6]。因此，麻疹也已被世界卫生组织（WHO）列为继全球消灭天花和即将消灭脊髓灰质炎之后下一个拟被消除的传染病。目前，麻疹减毒活疫苗虽已证明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和机体个体差异的原因，大约2%的受种者可出现暂时性皮疹[7]，部分会发生减毒活疫苗引起的疫苗相关麻疹病例（Vaccine-associated Measles Case，VAMC）。在疫苗时代的麻疹野病毒感染临床表现缺少典型性，多为轻型麻疹，与VAMC不易区分。

对疑似麻疹病例，符合以下5项标准可以诊断为VAMC[8]：⑴病人有出疹症状，伴有或不伴有发热，无咳嗽或其他与出疹相关的呼吸道症状；⑵出疹前7～14d曾接种过MCV；⑶接种MCV后8～56d采集血标本，检测其麻疹免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M阳性；⑷现场调查未发现任何与此病例相关的二代麻疹病例；⑸经现场流行病学调查和实验室检测无其他原因可以解释。

由于麻疹病毒只有一个血清型，依靠血清学检测无法区分是疫苗株，还是野毒株感染。目前，主要还是依靠基因序列分析的方法，来鉴定麻疹病毒是疫苗株，还是野病毒及其基因型。序列分析对实验室设备及人员要求较高，且需要时间较长，因此，建立一种简便快速容易操作的鉴别麻疹疫苗株与野毒株的方法非常必要。

逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）经AflⅡ酶切作用后，因中国麻疹病毒疫苗株基因在7666～7671bp位置有AflⅡ（CTTAAG）酶切位点，而其它所有23种基因型麻疹野病毒在此位置均无此酶切位点，不能被AflⅡ酶切，因此，我们采用本实验室于2011年引进建立的逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）方法[9]检测是否含有AflⅡ酶切位点对2015年江西省出疹前7～14d接种过MCV的2例疑似麻疹病例咽拭子标本进行麻疹疫苗株病毒快速鉴别。

在麻疹病毒的基因组中，血凝素（Hemagglutinin，H）蛋白基因和核蛋白（Nucleoprotein，N）基因是变异较大的基因，尤其是N基因羧基(COOH)末端450个核苷酸是麻疹病毒基因组中变异最大的区域。世界卫生组织(WHO)规定这450个核苷酸是鉴定基因型别所需的最少序列，扩增并测定此基因片段，并与WHO推荐的23种基因型参考株的序列做比较，以鉴定基因型[10，11]。因此，我们还对对2015年江西省2例疑似VAMC咽拭子标本N基因羧基末端450个核苷酸进行序列测定分析来验证鉴别结果。

1 材料与方法

1.1 标本采集对出疹前7～14d接种过MCV的2例疑似麻疹病例根据《全国麻疹监测方案》[12]要求进行血清学和病原学临床检测标本采集和运送。血清标本采集时间为接种MCV后8～56d，编号为2015JXMZX032和2015JXMZX035；咽拭子标本编号为2015JXMZY032和2015JXMZY035。

1.2 麻疹IgM抗体和风疹IgM抗体检测血清标本麻疹IgM抗体和风疹IgM抗体检测采用捕捉酶联免疫吸附（ELISA）方法，具体按照麻疹IgM抗体体检测试剂盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150203）和风疹IgM抗体检测试剂盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150304）操作说明书进行。

1.3 病毒RNA提取取咽拭子标本200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。1.4 RT-PCR-RFLP方法鉴别VAMC

1.4.1 RT-PCR反应体系和步骤引物扩增的靶序列为包含AflⅡ酶切位点（CTTAAG）的麻疹病毒H基因部分片段，见参考文献[9]，由上海生工合成，扩增产物大小为438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒（Cat No：210212），进行逆转录扩增，反应体系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/LdNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制剂（40U/μl）0.25μl、上下游引物(50μmol/L)各0.5μl、无RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反应条件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循环如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循环，72℃10min。

1.4.2 限制性片段长度多态性分析方法[9]酶切反应体系为：PCR产物10μl、AflⅡ酶（Takara公司）1μl和AflⅡ酶自带缓冲液2μl。每份标本均同时设阴性对照管，仅含原标本PCR反应产物10μl。另外，使用麻疹风疹联合减毒活疫苗（北京天坛生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）作为麻疹疫苗病毒阳性对照。酶切反应体系置于37℃水浴1h。将经37℃水浴1h后的对照管和酶切管中的PCR产物在含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 麻疹病毒N基因序列测定

1.5.1 麻疹病毒N基因序列扩增及测定引物扩增的靶序列为包含N基因羧基末端450个核苷酸片段，具体序列为，MeV216：5‘-TGGAGCTATGCC ATGGGAGT-3’和MeV2：145‘-TAACAATGATGG AGGGTAGG-3’，由上海生工合成。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit试剂盒（Cat No 210212）进行RT-PCR反应，相关操作按照试剂盒说明书进行。反应条件：60℃1min，42℃12min，50℃45mim，95℃15min，PCR循环如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循环，72℃10min。扩增出的基因片段送上海生工进行序列测定。

1.5.2 N基因序列分析运用Bioedit 7.0和MEGA 4.0软件对测定的序列与参比序列做基因序列分析和构建进化树。用于构建进化树的各参考株和标准株基因序列均从GenBank下载。

2 结果

2.1 麻疹IgM抗体和风疹IgM抗体检测2015JXMZX032和2015JXMZX035血清标本麻疹IgM抗体均为阳性，风疹IgM抗体均为阴性。

2.2 RT-PCR-RFLP方法快速鉴别VAMC结果2份咽拭子标本的RT-PCR阳性产物经Afl II酶切后，均被切成两个片段，呈两条带，分别为287bp、151bp，与目的酶切片段大小一致，见图1。

2.3 N基因序列测定结果运用Bioedit 7.0和MEGA 3.0软件对2份标本麻疹病毒N基因羧基末端450个核苷酸序列进行分析，并与世界卫生组织（WHO）公布的23种基因型30条参考序列以及中国麻疹疫苗株（沪191株）序列进行比较，构建基因进化树。结果显示，此两份标本与疫苗株代表株沪191株在同一进化小分支，Bootstrap值：100，一般认为进化树Bootstrap值大于70%具有统计学意义[13]；核苷酸同源性均为100%，提示这2份标本为麻疹疫苗株病毒A基因型，详见图2。序列测定结果与RT-PCR-RFLP方法的鉴定结果一致，2015JXMZY032和2015JXMZY035为麻疹疫苗株病毒。

图2 N基因羧基末端450个核苷酸系统进化树

3 讨论

2013年，国务院《卫生事业发展“十二五”规划》提出了要努力实现消除麻疹的目标[14]。加强适龄儿童含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）高水平的接种率，是实现消除麻疹目标的首要措施。目前江西省儿童免疫首剂接种使用麻疹风疹联合减毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，复种使用麻疹流行性腮腺炎风疹联合减毒活疫苗。随着麻疹减毒活疫苗的广泛使用，麻疹野病毒引起的病例会越来越少，而由疫苗株引起的麻疹样病例会越来越多，随着麻疹消除工作的进程，减毒活疫苗引起的疫苗相关麻疹病例会更加的凸显。

麻疹病毒、风疹病毒均可引起人群以发热、出疹为主要表现的急性呼吸道传染病，二者在临床症状上难以区分，有时甚至会出现两种病毒混合流行的暴发疫情[15-17]，因此，本研究对这2例疑似麻疹病例接种MCV后8～56d采集血标本血清标本同时进行麻疹IgM抗体和风疹IgM抗体检测，结果为麻疹IgM抗体阳性，风疹IgM抗体阴性，排除风疹病毒感染，为疑似麻疹病例。由于该2例疑似麻疹病例在出疹前7～14d接种过MCV，麻疹IgM抗体阳性，现场流行病学调查也未发现与此病例相关的二代麻疹病例，根据VAMC诊断标准，可以初步判断为VAMC。

本研究通过运用RT-PCR-RFLP方法快速鉴别了该2例疑似麻疹病例为麻疹疫苗相关麻疹病例，首次对我省麻疹疫苗株病毒的证实提供实验室证据。另外，本研究还对该2例病例咽拭子标本进行N基因羧基末端450个核苷酸序列测定和分析，在基因层面进一步证实。两种实验方法检测结果一致。

因此，科学、正确、及时地鉴别麻疹疫苗株病毒，为判定是否达到消除麻疹指标提供技术支撑，为我省麻疹预防与控制工作提供科学依据，对努力实现消除麻疹目标是非常重要的。

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Rapid identification of measles vaccine strain virus in Jiangxi Province in 2015

GONG Tian，ZHANG Yanni，SHI Yong，LI Jianxiong，ZHOU Jun.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective Using reverse transcription polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis method to identify rapidly the Measles vaccine strain virus in Jiangxi Province，in 2015.Methods We identifyed two cases of suspected vaccine associated measles throat swab specimens by detecting whether they contains Afl II enzyme cutting site with RTPCR-RFLP method.At the same time，the carboxyl terminal 450 nucleotides of N gene was sequenced and analyzed，confirming the result obtained by RT-PCR-RFLP method.Results The identification results of RT-PCR-RFLP method is that two throat swab specimens can be Afl II enzyme incision，and the N gene sequence determination results for measles vaccine strain virus of genotype A.Conclusion Our study provides laboratory evidence for measles vaccine strain in Jiangxi Province for the first time.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0174-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.011

2016-08-17；

2017-03-09)

龚甜，女，1982年生，硕士，副主任技师，主要从事麻疹和风疹等病毒的实验室监测工作。