CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用①

蔡天晶 黎志良 金凌应 甘云波

(湖北省通城县人民医院，通城437400)

CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用①

蔡天晶 黎志良 金凌应 甘云波②

(湖北省通城县人民医院，通城437400)

目的：探讨CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺泡上皮细胞中的作用。以及CD46和Nectin-4之间的相互作用。方法：分为麻疹病毒感染前处理组和感染后2 h组，均用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理人肺泡上皮细胞，并设对照组。检测细胞内病毒滴度的变化，采用Western blot和Real-time PCR检测NP蛋白的表达水平，并运用免疫共沉淀检测CD46与Nectin-4的相互作用。结果：与对照组相比，麻疹病毒感染前用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理的人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度显著降低，分别为对照组的48.03%和49.53%，同时用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理使病毒滴度下降为27.15%，差异均有统计学意义(P<0.01)。然而，在麻疹病毒感染2 h后用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理，人肺泡上皮细胞内麻疹病毒滴度和NP蛋白量未见显著减少。Western blot和Real-time PCR结果与上述结果一致；免疫共沉淀实验显示，CD46与Nectin-4存在相互作用。结论：CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染肺泡上皮细胞中起到介导作用，CD46与 Nectin-4可能存在协同作用，该作用对麻疹病毒的感染起到了增强效果。

麻疹病毒；人肺泡上皮细胞；CD46；Nectin-4

麻疹病毒表面有三种受体，分别为人膜辅蛋白(Membrane cofactor protein)CD46、淋巴细胞表面活化因子(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)以及髓灰质炎病毒受体样蛋白家族(Polio-virus receptor-like proteins，PVRLs)即上皮细胞表面黏附链接蛋白Nectin-4[1]。CD46在人体表达于除红细胞外的有核细胞上，是较早被发现的参与麻疹病毒实验室适应株及疫苗株感染的细胞表面分子[2]。而SLAM介导了野生型麻疹病毒的感染和入侵，SLAM在活化的B细胞、T细胞、单核细胞以及树突状细胞上均有表达[3]。Nectin-4广泛表达于人胎盘滋养层、胃腺、肺、乳腺及卵巢癌细胞，在扁桃体、口腔黏膜、食道、鼻咽和器官的柱状上皮细胞，以及肺巨噬细胞也有表达[4]。在2011年有研究者发现Nectin-4为麻疹病毒的另一个受体[5]，麻疹病毒实验室适应株或疫苗株、野生型均可以其作为受体，有助于麻疹病毒进出呼吸道。

肺泡上皮细胞上麻疹病毒受体有CD46和Nectin-4两种，然而它们在麻疹病毒感染肺泡上皮细胞中的相关作用还不清楚。为此，本研究采用分别沉默这两种细胞表面的麻疹病毒受体的方法，通过检测细胞内病毒含量的变化来验证CD46和Nectin-4受体在麻疹病毒侵袭过程中的作用。以及运用免疫共沉淀，探讨两种受体之间是否存在相互作用，从而研究麻疹病毒侵袭的可能机制，为麻疹预防提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒 人肺腺癌细胞系A549细胞购于美国模式培养物保藏所(ATCC)；麻疹病毒疫苗株(S191)购于武汉生物制品研究所。

1.1.2 主要试剂 Protein A琼脂糖珠购于美国Cell Signaling Technology公司；PVDF膜购于美国Millipore公司；ReverTra Ace qPCR RT kit 购于日本TOYOBO公司；BCA蛋白定量试剂盒购于美国Pierce公司；CD46 (D6N7H) Rabbit mAb (#13241)购于美国Cell Signaling Technology公司；Measles NP Antibody(sc-101355)、Nectin-4 Antibody(sc-515093)购于美国Santa Cruz公司；TRIzol reagent、SYBR Select Master Mix购于美国Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染实验 A549细胞接种于96孔板，用含10%FBS的1640培养基培养，待细胞达到约90%汇合率时，分别加入梯度稀释的病毒悬液，用培养基进行稀释，3个复孔。培养48 h后，在显微镜下观察噬斑并计数。

1.2.2 Western blot 获得的蛋白上清液经BCA蛋白定量后，加入还原性上样缓冲液，95℃，10 min变性；每孔上样量为80 μg；SDS-PAGE凝胶上电泳，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V。采用湿法转膜，使用PVDF膜，200 mA恒定电流转膜2 h；用TBS配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h后孵育一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜4次，5 min/次，二抗室温孵育1 h；TBST洗膜4次，5 min/次，显影。

1.2.3 Real-time PCR 细胞汇合率约90%时，对细胞进行相应的处理，培养24 h后，用TRIzol reagent裂解液裂解细胞，并提取细胞总RNA；使用TECAN酶标仪检测OD值，检测总RNA的含量以及纯度，获得的总RNA进行逆转录后进行Real-time PCR；按照ReverTra Ace qPCR RT kit说明书体系进行逆转录合成cDNA的第一条链；以获得的cDNA作为模版，使用SYBR Select Master Mix进行Real-time PCR，设置3个复孔；反应引物Upstream primer：5′-CATTACATCAGGATCCGG-3′；Downstream primer：5′-GTATTGGTCCGCCTCATC-3′，反应体系见表1。

反应条件如下：步骤 1:变性；95℃ 30 s。步骤2:反应，采集信息；95℃ 5 s；60℃ 40 s 40个循环。步骤3:溶解曲线生成；95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s；60℃ 15 s。

1.2.4 免疫共沉淀 收集病毒感染24 h后的细胞，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，置于冰上裂解30 min后，30 000 r/min 4℃离心30 min；获得的上清液取少量以备Western blot分析，向剩余的上清液中加入1 μg相应的抗体，4℃旋转孵育过夜；将10 μl Protein A 琼脂糖珠用适量细胞裂解液洗涤，3 000 r/min离心3 min，重复3次；预处理过的10 μl Protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的上清液中4℃旋转孵育4 h后，4°C，3 000 r/min离心3 min；收集上清液；沉淀用1 ml细胞裂解液洗涤4次；获得的琼脂糖珠沉淀用20 μl裂解液重悬，进行Western blot实验分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件处理所有数据，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05定义为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD46和Nectin-4对S191感染A549细胞的影响 A549细胞接种于96孔板，培养24 h，汇合率约90%时，对细胞分别进行如下处理：(1)分别加入抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体，对细胞进行预处理，37℃培养箱孵育2 h后，加入麻疹病毒疫苗株(S191)；(2)加入麻疹病毒疫苗株(S191)，37℃培养箱孵育2 h后加入抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体。对上述处理的细胞培养48 h后在光学显微镜下计数噬斑的个数。结果显示，在病毒感染细胞前，用抗CD46抗体或抗Nectin-4抗体分别处理的A549细胞中麻疹病毒滴度显著减少，为对照组的48.08%和49.53%，经抗CD46抗体及抗Nectin-4抗体共同处理的A549细胞中，麻疹病毒滴度进一步减少，为对照组的27.15%，如图1A所示；然而，在病毒感染2 h后，用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体分别或同时处理的A549细胞中，麻疹病毒滴度未见显著减少，如图1B所示。

表1 反应体系

Tab.1 Reaction system

ReagentDosageSYBRSelectMasterMix(2×)10μlForwardprimer(10μmol/L)0.4μlReverseprimer(10μmol/L)0.4μlcDNAtemplate(5timedilution)2μlDoublesteamingwater7.2μlTotal20μl

图1 抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体对麻疹病毒滴度的影响Fig.1 Effection of CD46 antibody resistance and Nectin-4 antibody resistance on measles virus dropsNote: A.The processing results before measles vivus infection;B.The processing results after measles virus infection 2 h.

图4 CD46和Nectin-4的相互作用Fig.4 Interact with each other of CD46 and Nectin-4

A549细胞用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体在麻疹病毒感染前和感染2 h后处理，用Western blot和Real-time PCR试验检测麻疹病毒NP蛋白的表达量，结果如图2和图3所示，与图1的结果保持一致。

2.2 S191感染A549细胞时CD46和Nectin-4的相互作用 麻疹病毒感染的A549细胞培养24 h后收取细胞总蛋白，进行免疫共沉淀实验。结果如图4所示，用抗CD46抗体共沉淀得到的复合物中能检测到Nectin-4，同样，用抗Nectin-4抗体共沉淀得到的复合物中能检测到CD46。

3 讨论

麻疹病毒为具有包膜的、不分节段的负链RNA病毒，传染性强，感染人体后急性期症状表现为发热、畏光、咳嗽、流涕以及全身性红疹[6]。尽管麻疹疫苗的广泛使用大大降低了麻疹病毒的传播和爆发，但全世界每天仍有约400人因感染麻疹病毒而死亡[6,7]。作为传染性最强的疾病之一，麻疹在我国仍持续流行。麻疹病毒也是引起小儿麻疹的病原体，有报告显示，中国在2012年和2013年，<8月龄婴儿在所有年龄段中发病率最高(分别为13.52/10万、74.52/10万)，其次是8～23月龄和2～6岁龄儿童[8]。

本实验探究了CD46、Nectin-4在麻疹病毒感染人肺癌细胞株A549细胞中的作用，以及CD46和Nectin-4的相互作用关系。结果显示，在麻疹病毒感染前用抗CD46抗体或抗Nectin-4抗体处理后，A549细胞中麻疹病毒的表达量下降，提示封闭CD46或Nectin-4的受体结合位点，麻疹病毒的感染能力下降。用抗CD46抗体和抗Nectin-4抗体联合处理后的A549细胞，麻疹病毒的感染能力进一步下降。该结果证实了CD46和Nectin-4有介导麻疹病毒感染A549细胞的作用。另外，由免疫共沉淀实验发现CD46和Nectin-4在麻疹病毒感染细胞的过程中起着协同作用。然而，在麻疹病毒感染2 h之后，用抗CD46抗体、抗Nectin-4抗体处理，麻疹病毒滴度未有明显变化。本结果揭示了麻疹病毒载量减少可能主要是由于进入细胞的病毒减少，而非感染后的复制能力下降。

细胞受体是病毒入侵易感细胞和启动感染的关键。麻疹病毒细胞受体——膜辅蛋白CD46、SLAM与麻疹病毒血凝素(MV-H)形成复合体的结构[9,10]；而Nectin-4是近期在上皮细胞中鉴别的一种受体，可接触麻疹病毒并帮助其穿过上皮细胞，在麻疹病毒进出人体呼吸道时起关键作用[4]。既往研究发现人类Nectin-4细胞膜远端结构域与MV-H形成的复合体的结构，表明Nectin-4受体结合位点和其他两种受体的结合位点存在广泛重叠，也就是说该结合位点代表了抗病毒药物一个有潜力的靶点[11]。因此，封闭麻疹病毒的受体结合位点CD-46和/或Nectin-4，可能阻断其对宿主细胞的结合和入侵，从而减少对宿主细胞的感染和向邻近细胞的扩散。

本实验在细胞水平对麻疹病毒受体在病毒感染细胞的过程进行了研究，但具体机制还需要进一步明确，且尚需在动物水平上进一步的验证本发现。

[1] Haralambieva IH,Kennedy RB,Ovsyannikova IG,etal.Variability in humoral immunity to measles vaccine:new developments[J].Trends Mol Med,2015,21(12):789-801.

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[3] Tatsuo H,Ono N,Tanaka K,etal.SLAM (CDw150) is a cellular receptor for measles virus[J].Nature,2000,406(6798):893-897.

[4] Singh BK,Hornick AL,Krishnamurthy S,etal.The Nectin-4/Afadin protein complex and intercellular membrane pores contribute to rapid spread of measles virus in primary human airway epithelia[J].J Virol,2015,89(14):7089-7096.

[5] Muhlebach MD,Mateo M,Sinn PL,etal.Adherens junction protein nectin-4 is the epithelial receptor for measles virus[J].Nature,2011,480(7378):530-533.

[6] Naim HY.Measles virus[J].Hum Vaccin Immunother,2015,11(1):21-26.

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[10] Hashiguchi T,Ose T,Kubota M,etal.Structure of the measles virus hemagglutinin bound to its cellular receptor SLAM[J].Nat Struct Mol Biol,2011,18(2):135-141.

[11] Zhang X,Lu G,Qi J,etal.Structure of measles virus hemagglutinin bound to its epithelial receptor nectin-4[J].Nat Struct Mol Biol,2013,20(1):67-72.

[收稿2016-07-08 修回2016-09-07]

(编辑 倪 鹏)

Role of CD46 and Nectin-4 on Measles virus (MV) infecting human pulmonary alveolar epithelial cells

CAITian-Jing,LIZhi-Liang,JINLing-Ying,GANYun-Bo.

TongchengPeople′sHospitalofHubeiProvince,Tongcheng437400,China

Objective:To investigate the role of CD46 and Nectin-4 on Measles virus (MV) infecting human pulmonary alveolar epithelial cells (HPAEpiC),and the interaction between CD46 and Nectin-4.Methods: Measles virus was divided into pre-infection group and 2 h-infection group,HPAEpiCs treatment with anti-CD46 antibody and/or anti-Nectin-4 antibody as experimental groups,and untreated HPAEpiCs as a control.The variation of viral replication level was detected.A Co-immunoprecipitation assay (Co-IP) was used to explore whether CD46 and Nectin-4 had interactive relationship in MV infection.Results: Compared with the control group,MV titers were reduced in HPAEpiCs of the pre-infection group treated with anti-CD46 and anti-Nectin-4 respectively (48.03% and 49.53%).Furthermore,virus titers showed a more reduction in which treated with anti-CD46 and anti-Nectin-4 antibodies (27.15%,P<0.01).Western blot and Real-time PCR showed that anti-CD46 antibody and anti-Nectin-4 antibodies decreased the rate of MV infection.In the 2 h-infection group,however,the treatment with anti-CD46 and anti-Nectin-4 could significantly reduce the MV titer and NP protein in HPAEpiCs.The Co-IP assay showed that there were interaction between CD46 and Nectin-4.Conclusion: CD46 and Nectin-4 mediated MV infecting HPAEpiCs.Moreover,CD46 and Nectin-4 may play a synergetic role in MV infection,which could enhance the infection effect.

Measles virus；Human pulmonary alveolar epithelial cells；CD46；Nectin-4

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.07.007

蔡天晶(1963年-)，男，主任医师，主要从事心肺疾病及发病机制方面的研究，E-mail:caitianjin2016@126.com。

R373.1

A

1000-484X(2017)07-0991-04

①本文为湖北省卫生与计划生育委员会项目(No.WJ2015MB301)。

②湖北文理学院医学院，襄阳441000。