1株酱香型大曲中高温放线菌的分离和鉴定

王芙蓉，曾辉，许曌昕，席德州，王欢，曹文涛

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州盛世甲秀酒业有限公司，贵州贵阳550025）

1株酱香型大曲中高温放线菌的分离和鉴定

王芙蓉1，曾辉2，许曌昕1，席德州1，王欢1，曹文涛1

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；2.贵州盛世甲秀酒业有限公司，贵州贵阳550025）

利用GTY培养基自酱香型高温大曲中分离得到1株放线菌F6，对其进行形态学、生理生化代谢特征鉴定，并结合16S rRNA基因序列分子生物学鉴定及系统发育学分析，结果表明，鉴定F6为高温放线菌（Thermoactinomycessp）中的普通高温放线菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

酱香型白酒；高温大曲；高温放线菌；分离鉴定

酱香型白酒是以高温大曲为糖化发酵剂，并通过高温堆积后入窖进行多菌种复合固态纯粮发酵而得，期间涉及了多种微生物的参与，这些微生物在白酒酿造阶段的含量及发酵产物不同对酱香型白酒的风味都有很大的影响。白酒香味物质的形成更是与高温大曲中的有益微生物有着紧密的关系。从微生物角度来说，高温制曲过程中淘汰了大量耐热性差的微生物，因此高温培养的过程实际上相当于一个富集嗜热菌的过程。放线菌是白酒酿造过程中众多微生物的一种，近年来对它与产香的关系有了较为深入的研究[1-5]。本实验主要是以酱香型高温大曲为原料，分离出高温大曲中的嗜热放线菌，在前人研究的基础上对分离到的放线菌进行生理生化检测和基因测序，为进一步探索该菌与酱香型白酒特殊风味的相关性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：茅台镇某酒厂生产的酱香型高温大曲。

菌株：F6分离自茅台镇某酒厂生产的酱香型高温大曲。

培养基：GTY培养基、ISP2培养基等。

试剂及耗材：TaqDNA聚合酶购自天为时代生物有限公司；Gold View购自北京塞百盛基因技术有限公司；溶菌酶购自Sigma公司，蛋白酶K购自Merk公司，制霉菌素，新制霉素。

主要仪器：超净工作台、灭菌锅、高速冷冻离心机、培养箱等。

1.2 实验方法

1.2.1 放线菌的分离筛选

1.2.1.1 样品的预处理

称取25 g酱香型高温大曲、5 g CaCO3于500m L的三角瓶中，加入5m L无菌水使其保持湿润，在28℃的培养箱中培养3 d后，在100℃的烘箱中热处理1 h，加入225m L的无菌水，在200 r/m in的摇床上振荡30m in后，在55℃的水浴中保持1 h。

1.2.1.2 抑制剂的选择

将GTY培养基灭菌后冷却到50℃，以无菌过滤的方法加入30mg/m L的新制霉素和20mg/m L的制霉菌素。

1.2.1.3 培养

将经过预处理的样品涂布到GTY培养基上，在55℃下培养48 h[6]。

1.2.2 形态学观察

将F6菌株接种到ISP2培养基中，采用插片法培养3 d后，再观察是否形成基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。并在显微镜下观察菌株的气生菌丝、基内菌丝、孢子丝等生长情况[7]。

1.2.3 温度敏感性测定

将检测菌接种在ISP2培养基上，分别置于45℃、50℃、55℃、60℃4个温度梯度下培养48 h后，观察其生长状况。

1.2.4 生理生化特性

生理生化特性鉴定选取明胶液化、淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、硝酸盐还原等项目进行。

1.2.4.1 明胶液化[8]

将菌种接种于明胶培养基中，以55℃培养，分别在3 d、5 d、10 d、20 d和30 d观察培养基液化程度。在观察前先将菌种管放入冰箱30m in，如明胶凝成固体状态，说明不液化，如试管有液体出现，说明明胶已被液化。

1.2.4.2 淀粉水解[8]

将菌种接种在淀粉琼脂面板上，以55℃培养10 d后，在菌落周围滴加碘液，如菌落周围呈现透明圈时，表示菌种产生淀粉酶。若菌落周围染成蓝色，不出现透明圈者，说明该菌株不产生淀粉酶。

1.2.4.3 牛奶的凝固与胨化[8]

将菌种接种在脱脂牛奶管中，以55℃培养，分别在第3天、第6天、第10天、第20天、第30天各观察1次，如果牛奶形成凝块，为凝固现象。再继续培养，如凝块分解，则为胨化现象。

1.2.4.4 硝酸盐还原

将菌种接种在硝酸盐还原培养液中，55℃培养7 d和14 d，分别测定硝酸盐还原的情况。测定时，倒出培养液1m L于干净试管中，分别加入硝酸盐还原试剂甲液和乙液各2滴，如呈红色反应，即为阳性。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析

1.2.5.1 16S rRNA基因PCR扩增和序列测定

利用Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒（上海生工）提取菌株基因组DNA，并以基因组DNA为模板，利用通用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增，纯化后的PCR产物送往上海生工进行基因测序。

1.2.5.2 同源性分析与系统发育分析

登陆NCBI（www.ncbi.nlm.gov/blast/）网站，进行同源性分析，并采用MEGA 5.2将测得序列与GenBank中的模式菌株16S rRNA序列进行分析，构建系统发育树，获得目的菌的分类地位或它的系统发育地位。

2 结果与分析

2.1 形态学观察

放线菌菌株F6在ISP2培养基上55℃插片培养3 d，菌株的形态观察结果描述见表1，菌落特征和显微镜观察结果见图1。

表1 放线菌F6的培养特征

2.2 温度敏感性测定

菌株F6在60℃条件下不生长，在45～55℃温度范围内生长，且最适生长温度为55℃，结果见表2。

2.3 生理生化特征鉴定

菌株F6能够使牛奶凝固，且胨化；能还原硝酸盐为亚硝酸盐，具体结果见表3。

图1 放线菌的特征

表2 放线菌菌株温度敏感性特征

表3 菌株F6生理生化结果

图2 菌株F6的测序结果

2.4 16S rRNA基因系统发育分析

对菌株F6进行了16S rRNA扩增，扩增产物进行了序列测定，测定结果见图2。菌株的系统发育树见图3。可确定F6为普通高温放线菌（Thermoactinomycesvulgaris）。

3 讨论及结论

图3 菌株F6的系统发育树

《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第9版中所描述的放线菌目，能产生单孢子的放线菌归为4个属，即高温放线菌属、高温单孢菌属、糖单孢菌属和小单孢菌属[9]。高温放线菌属（Thermoactinomyces）于1899年由Tsilinsky[10]首次描述。它是20世纪前人类所发现的为数不多的几个放线菌属之一。该属的特征是在高温环境下生长快，在气丝和基丝上均有单个孢子形成，存在内生孢子，常见于自然界的高温场所，如堆肥、稻草、蔗渣等。高温放线菌属因其能够形成良好的菌丝体而被归入放线菌目中，但最近有不少学者对该属分类地位提出质疑，这不仅是因为其基于16S rDNA序列分析证明该属的系统进化更接近于芽孢杆菌属，它们还产生具有类似芽孢杆菌属的内生孢子，而且它们的G+Cmol%仅为50%左右，远远低于其他放线菌属的65%～75%。根据分子分类研究结果，有学者将该属并入枯草杆菌菌群。但根据其形态学特征，高温放线菌属明显应归为放线菌类群。现今，国内外许多有关学者均暂时将其定位在放线菌类群中的未定单元里[11]。高温放线菌属从其建立至今已有100多年的历史，其存在数量多，分布非常广泛，但到目前为止，仅有为数不多的几个种被发现并生效描述，这说明发现新的高温放线菌的潜力还是非常大的。本研究利用细菌通用引物对F6菌16S rRNA基因序列扩增和序列测定，并通过GenBank数据库进行分析比较和利用MEGA5进行系统进化分析，F6被鉴定为高温放线菌（Thermoactinomyces sp.）。以基因系统发育分析为基础，结合生理生化试验、形态及培养特征结果，并参考Yoon等[12]的相关报道，最终确定放线菌F6为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）。该菌从酱香型白酒高温大曲中被发现并分离得到，本研究尚属首次。由于高温放线菌生长发育较快，分泌产生的代谢物种类和性质可能会具有其特殊性，由此可以推测该菌作为优势菌种在酱香型白酒特殊性风味的形成过程中具有不可忽视的作用。对其进行全面、准确的多相分类学鉴定是研究其在白酒酿造过程中所发挥功能的必要前提。

本研究针对自酱香型白酒高温大曲中分离得到的嗜热放线菌F6进行多相分类学鉴定，并最终将F6鉴定为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）。该菌株具有特殊的生理生化特征及酶学活性，且是首次从我国酱香型白酒高温大曲中分离并鉴定得到的高温放线菌，具有重要的理论研究与实践应用价值。

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[12]YOON JH,KIM IG,SHIN Y K,etal.Proposalof the genus Thermoactinomyces sensu stricto and three new genera,Laceyella,Thermoflavimicrobium and Seinonella,on thebasisof phenotypic,phylogenetic and chemotaxonom ic analyses[J].International journalof systematic and evolutionarym icrobiology,2005,55(1)：395-400.

Isolation&Identification of a Thermoactinomyces sp.Strain from High-tem perature Jiangxiang Daqu

WANG Furong1,ZENG Hui2,XU Zhaoxin1,XIDezhou1,WANGHuan1and CAOWentao1
(1.Schoolof Liquor-making&Food Engineering,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025; 2.Shengshi Jiaxiu Distillery Co.Ltd.,Guiyang,Guizhou 550025,China)

An actinomycetes strain F6 was isolated from high-temperature Jiangxiang Daqu by use of GTY culturemediums.Itsmorphology,physiological features,biological features,andmetabolic featureswere studied.Combined w ith 16S rRNA gene sequencemolecularbiology identification and phylogenetic analysis,strain F6was identified as Thermoactinomycesvulgaris.

Jiangxiang Baijiu;high-temperature Daqu;Thermoactinomyces sp.;isolation&identification

TS262.3；TS261.1；TS261.4

A

1001-9286（2017）04-0042-04

10.13746/j.njkj.2017004

2017-01-09

王芙蓉（1991-），女，在读硕士研究生，研究方向：酿酒微生物，E-mail：790251343@qq.com。

曹文涛（1967-），男，贵州人，研究生导师，主要从事白酒微生物的研究及其应用，E-mail：cw tgz@163.com。