某蛋鸡场金黄色葡萄球菌和沙门菌的分离鉴定及药物敏感性分析

黄文青 , 李博文 ， 高 彤 ， 王豪举 ， 丁红雷

(1. 西南大学附属中学 ， 重庆北碚400700 ； 2. 西南大学动物科技学院 ， 重庆北碚400715)

某蛋鸡场金黄色葡萄球菌和沙门菌的分离鉴定及药物敏感性分析

黄文青1, 李博文1， 高 彤2， 王豪举2， 丁红雷2

(1. 西南大学附属中学 ， 重庆北碚400700 ； 2. 西南大学动物科技学院 ， 重庆北碚400715)

为了解某蛋鸡场金黄色葡萄球菌和沙门菌对抗菌药物的耐药情况，采集重庆市某蛋鸡场48份羽毛样品、123份肛拭子样品，将羽毛样品经MH高盐培养液增菌后划线接种于MH高盐平板，将肛拭子样品经沙门菌增菌液增菌后划线接种于S.S.平板。将疑似菌落接种LB液体培养基培养后提取基因组，PCR扩增金黄色葡萄球菌特异性nuc基因和沙门菌特异性invA基因片段。对分离鉴定的金黄色葡萄球菌和沙门菌进行药物敏感性试验。最终共分离鉴定出9株金黄色葡萄球菌、6株沙门菌。药敏试验结果表明，分离的金黄色葡萄球菌和沙门菌耐药严重，且存在多重耐药。本研究基本摸清了该蛋鸡场金黄色葡萄球菌和沙门菌对常见抗菌药物的敏感性，为该蛋鸡场的临床用药提供了参考。

金黄色葡萄球菌 ； 沙门菌 ； 分离鉴定 ； PCR ； 药物敏感性试验

20世纪90年代以来，随着我国集约化养殖业的迅速发展和抗菌药物在动物饲养中的广泛应用，动物源性病原菌的耐药问题越来越严重，由此引起的公共卫生事件也越来越多。金黄色葡萄球菌和沙门菌均是常见的人兽共患病病原菌。加强这两种细菌在养殖场中耐药情况的监测，有利于养殖场的合理用药，减少抗菌药物的使用，减少耐药菌株的比例，还能减少食物链中耐药菌株向人传递的几率，具有一定的公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1 菌株 金黄色葡萄球菌菌株CQHC4CSA002、沙门菌菌株CQ4CSCS005、质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC®25923和大肠杆菌ATCC®25922由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Mueller-Hinton培养基、S.S.培养基、革兰染色液，购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×TaqMaster Mix和DNA Marker DM-5 000，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 药敏试纸 32种药敏试纸，购自杭州天和微生物试剂有限公司。(1)β-内酰胺类：(A)青霉素类：青霉素G、氨苄西林、阿莫西林；(B)头孢类：头孢拉定、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢他啶；(C)氨曲南；(2)氨基糖苷类：链霉素、卡那霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；(3)四环素类：四环素、强力霉素；(4)酰胺醇类：氯霉素、氟苯尼考；(5)大环内酯类：红霉素、阿奇霉素；(6)林可胺类：林可霉素、克林霉素；(7)多肽类：万古霉素；(8)磺胺类：甲氧嘧啶、复方新诺明；(9)喹诺酮类：恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星。

1.4 方法

1.4.1 样本采集和处理 2015年1-3月，分两次于重庆市某蛋鸡场采集羽毛样品48份(第1次10份，第2次38份)，肛拭子样品123份(第1次63份，第2次60份)。肛拭子样品的采集采用无菌棉签蘸取泄殖腔粪便。采集的样品置于灭菌离心管中，然后放入有冰袋的泡沫箱中，6 h之内运回实验室。

采集的羽毛样品直接加入Mueller-Hinton高盐増菌液中，220 r/min 37 ℃培养8 h。增菌后的菌液划线接种于Mueller-Hinton高盐平板，37 ℃培养24 h后置于4 ℃ 5 d。每个平板挑取3～5个浅黄色、黄色或橙色疑似金黄色葡萄球菌单菌落划线接种于LB平板，37 ℃培养18 h。

装有肛拭子样品的离心管中加入1.5 mL灭菌PBS，震荡后静置2 h，再次震荡混匀，取200 μL液体于S.S.增菌液中，220 r/min 37 ℃摇床培养6～8 h。增菌后的菌液划线接种于S.S.平板，37 ℃培养18～24 h。挑取3～5个中间黑色的单个菌落划线接种于LB平板，37 ℃培养18 h。1.4.2 临床菌株的PCR检测

1.4.2.1 引物设计与合成 根据GenBank 中公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和沙门菌invA基因序列，用Primer Premier 5.0设计特异性引物。扩增nuc基因片段的引物：nuc-F：5′-AGGGATGGCTATCAGTAAT GTTTC-3′和nuc-R：5v-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′，扩增invA基因片段的引物：invA-F：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′和invA-R：5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC C-3′。

1.4.2.2 菌株PCR模板的制备 挑取有金黄色葡萄球菌/沙门菌典型菌落特征的单个菌落接种LB液体培养基，220 r/min 37 ℃培养8 h。取新鲜培养的菌液2 mL 12 000 r/min离心1 min，弃上清；加入1 mL ddH2O，重悬，立即12 000 r/min离心1 min，弃上清；加入50 μL ddH2O，105 ℃处理10 min。保存于-20 ℃备用。

1.4.2.3 临床菌株的PCR鉴定 扩增nuc/invA基因片段PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 10 μL，nuc-F/invA-F(10 μmol/L)0.5 μL，nuc-R/invA-R(10 μmol/L)0.5 μL，模板0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，总反应体系20 μL。

扩增nuc/invA基因片段PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸6 min。以金黄色葡萄球菌CQHC4CSA002和沙门菌CQ4CSCS005作为阳性对照。1.4.3 药物敏感性试验 纸片法测定分离菌株对32种抗菌药物的敏感性。参照《动物源细菌抗菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准(2013版)》和《抗菌药物敏感性试验执行标准；第二十三版资料增刊》的方法操作与进行结果判定。

2 结果

2.1 菌株分离情况 将平板上疑似为金黄色葡萄球菌的菌落经PCR扩增nuc基因片段，最终共鉴定出9株金黄色葡萄球菌(图1)，分离率为22.9%。菌株CQ5CSCSA001和CQ5CSCSA002分离于2015年1月，菌株CQ5CSCSA003-CQ5CSCSA009分离于2015年3月(表1)。

图1 金黄色葡萄球菌临床分离株的PCR鉴定结果

采样日期采样份数分离菌株数分离率/%菌株编号2015．1．1510220．0CQ5CSCSA001⁃CQ5CSCSA0022015．3．2038723．7CQ5CSCSA003⁃CQ5CSCSA009合计48922．9

将平板上疑似为沙门菌的菌落经PCR扩增invA基因片段，最终共鉴定出6株沙门菌(图2)，分离率为4.9%。CQ5CSCS001-CQ5CSCS003分离于2015年1月，CQ5CSCS004-CQ5CSCS006分离于2015年3月(表2)。

图2 沙门菌临床分离株的PCR鉴定结果

采样日期采样份数分离菌株数分离率/%菌株编号2015．3．206334．8CQ5CSCS001⁃CQ5CSCS0032015．7．276035CQ5CSCS004⁃CQ5CSCS006合计12364．9

2.2 药物敏感性试验结果 由表3可知，9株金黄色葡萄球菌临床株对氨苄西林完全耐药；8株菌对青霉素G、阿莫西林、头孢拉定、阿奇霉素、林可霉素、克林霉素耐药；7株菌株对诺氟沙星、甲氧嘧啶、复方新诺明、四环素、强力霉素、氯霉素、红霉素耐药；6株菌对头孢唑啉、头孢他啶和环丙沙星耐药；5株菌对氟苯尼考耐药；即有18种药物的耐药率超过50%。所有金黄色葡萄球菌临床分离株对头孢噻吩敏感；对头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻肟和庆大霉素耐药的菌株仅有1株，对阿米卡星和妥布霉素耐药的菌株有2株，对头孢氨苄、恩诺沙星耐药的菌株有3株，对卡那霉素、氧氟沙星耐药的菌株有4株。

6株沙门菌临床株对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢噻肟、链霉素、恩诺沙星、甲氧嘧啶、复方新诺明、四环素、强力霉素、万古霉素、氯霉素、红霉素17种药物完全耐药；对头孢曲松和氟苯尼考耐药菌株有5株。超过22种药物的耐药率超过50%。庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素和诺氟沙星对所有分离菌敏感；其中庆大霉素和妥布霉素对所有菌株完全敏感。

目前还没有氨曲南、链霉素和万古霉素对金黄色葡萄球菌，林可霉素和克林霉素对沙门菌的耐药标准，故没有进行药物敏感性试验。两株质控菌株对所测定的所有抗菌药物均敏感。

3 讨论

细菌耐药已成为全球面临的最严重公共卫生挑战之一。1959年甲氧西林首次用于耐青霉素金黄色葡萄球菌引起感染的治疗[1]，而1961年报道，在丹麦分离到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)[2]，随后欧洲其他国家、日本和美国等陆续分离到MRSA[1]。除金黄色葡萄球菌外，其他细菌的耐药菌株也已经广泛存在，特别是2016年5月26日，美国卫生官员报告称，美国发现首例对所有已知抗生素有抵抗力的细菌感染病例[3]。

人体内耐药菌株的存在与动物源性食品随食物链进入人体密切相关[4]。有研究报道，定植于猪体内的MRSA能够引起人类的疾病[5]。还有报道分离于患乳房炎奶牛的MRSA与分离于人的MRSA基因型十分相似[6]。由此可见，加强对养殖场中细菌耐药性的监测，了解养殖场内重要病原菌的耐药表型，从而采取针对性的防控措施具有十分重要的意义。

本试验在蛋鸡场分离的金黄色葡萄球菌和沙门菌对多种抗菌药物具有耐药性，特别是沙门菌，所有的分离菌株对17种抗菌药物完全耐药，由此可见，该养殖场菌株的耐药非常严重。令人奇怪的是，这些菌株对一些在产蛋鸡禁用的抗菌药物仍有极强的耐药性，如氨苄西林、阿莫西林，这可能是由于其他同类药物的使用造成的交叉耐药；对于喹诺酮类和磺胺类药物的耐药则可能是由于蛋鸡在幼龄时使用此两类药物，从而细菌产生耐药性而造成的；对于氯霉素的耐药则可能是由于产蛋前氟苯尼考的使用造成，因为氯霉素和氟苯尼考具有相同的耐药基因，如cat。万古霉素一般不应用于蛋鸡，而本次试验分离的沙门菌对万古霉素完全耐药，这可能是环境中的耐万古霉素菌株持续存在，将耐药基因传递给本养殖场的细菌有关[7]。

本研究为该蛋鸡场抗菌药物的使用提供了参考，有利于提高药物使用的针对性，并通过药物的交替使用降低耐药菌株的比例。在后续的研究中将继续增大样本采集量和采集范围，使样品更有代表性。

表3 金黄色葡萄球菌和沙门菌临床分离株对抗菌药物的敏感性

S：敏感； I：中度敏感； R：耐药

[1] Eniright M C, Robinson D A, Randle G,etal. The evolutionary history of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002, 99 (11): 7687-7692.

[2] Eriksen K R. "Celbenin"-resistant staphylococci [J]. Ugeskr Laeger, 1961, 123: 384-386.

[3] http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2016/5/347278.shtm.

[4] Bortolaia V, Espinosa-Gongora C, Guardabassi L,etal. Human health risks associated with antimicrobial-resistant enterococci andStaphylococcusaureuson poultry meat [J]. Clinical Microbiology and Infection, 2016, 22 (2): 130-140.

[5] Jamrozy D M, Fielder M D, Butaye P,etal. Comparative genotypic and phenotypic characterisation of methicillin-resistantStaphylococcusaureusST398 isolated from animals and humans [J]. PLoS One, 2012, 7 (7): e40458.

[6] Juhász-Kaszanyitzky E, Jánosi S, Somogyi P,etal. MRSA transmission between cows and humans [J]. Emerging Infectious Diseases, 2007, 13 (4): 630-632.

[7] Quintana-Hayashi M P, Thakur S. Phylogenetic analysis reveals common antimicrobial resistantcampylobactercolipopulation in antimicrobial-free (ABF) and commercial swine systems [J]. PLoS One, 2012, 7 (9): e44662.

Isolation,identification and antibiotic sensitivity analysis ofStaphylococcusaureusandSalmonellafrom a layer-raising farm

HUANG Wen-qing1, LI Bo-wen1, GAO Tong2, WANG Hao-ju2, DING Hong-lei2

(1.High School Affiliated to Southwest Univeristy, Chongqing 400700, China;2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The purpose of the study is to acquire the information of the antibiotic sensitivity of hen-associatedStaphylococcusaureus(S.aureus) andSalmonellain a layer-raising farm in Chongqing. Forty eight feather samples and 123 fecal samples were collected. The feather samples were cultured in high-salt MH medium and then cultured on high-salt MH plates. Fecal samples were cultured in SS medium and then cultured on SS plates. The suspected colonies were cultured in LB media. TheS.aureusspecific genenucandSalmonellaspecific geneinvAwere amplified from the suspected colonies, and the antimicrobial susceptibility of the identifiedS.aureusandSalmonellawere tested with 32 antibacterials. NineS.aureusisolates and 6Salmonellaisolates were identified from samples. Antibiotic sensitivity assay showed that the drug resistances ofS.aureusandSalmonellato antibacterials were serious. This study implies that the antibiotic sensitivity ofS.aureusandSalmonellato commonly used antibacterials is severe and provides some useful data for the clinical medication in the layer-raising farm.

Staphylococcusaureus;Salmonella; isolation and identification; PCR; antibiotic sensitivity assay Corresponding author：DING Hong-lei

2016-07-21

国家重点基础研究发展计划项目(2013CB12720)；重庆市中小学创新人才工程项目(CY150205)

黄文青(1999-)，女，高中生，主要研究兴趣为微生物耐药，E-mail：474164278@qq.com

丁红雷，E-mail：hongleiding@swu.edu.cn

Q933

A

0529-6005(2017)03-0042-04