马链球菌兽疫亚种PGK蛋白的免疫保护试验

付 强， 罗惠娜， 王爱富， 李桂珍， 马春全

(佛山科学技术学院 ， 广东佛山528231)

马链球菌兽疫亚种PGK蛋白的免疫保护试验

付 强， 罗惠娜， 王爱富， 李桂珍， 马春全

(佛山科学技术学院 ， 广东佛山528231)

为了阐明马链球菌兽疫亚种(SEZ)PGK蛋白的免疫保护作用，使该菌引起猪、马、牛等多种动物的链球菌病得到有效控制，本试验构建PGK重组表达载体，纯化重组蛋白，对其免疫效力进行系统评价。结果表明：PGK蛋白可以诱导高滴度的血清IgG抗体，并且可提供一定的免疫保护效力；Real-time PCR技术分析表明，PGK是一个重要的体内诱导抗原；并且可诱导高水平的Th1和Th2型免疫应答，揭示PGK在SEZ治病过程中起到重要作用，为新型疫苗的研制奠定了基础。

SEZ ； PGK ； 抗原 ； 新型疫苗 ； 致病机制

马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequissp.zooepidemicus, SEZ) 属于乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，能引起猪、马、奶牛等多种动物发病，在我国主要引起猪链球菌病[1-3]。猪链球菌病是危害养猪业的重要细菌性疾病，严重危害我国乃至世界养猪业的发展。

现有的研究对SEZ的毒力因子和保护抗原缺乏全面的了解，因此现阶段控制SEZ感染仍然存在很多困难，近期一些SEZ菌株的基因组测序结果让我们对该菌的发病机制有了新的见解，有利于我们进行SEZ疫苗的研发。PGK与肺炎链球菌的保护性抗原具有一定的同源性[4-5]，可能是SEZ新型疫苗的候选抗原，本试验通过克隆表达PGK蛋白，探讨该重组蛋白在SEZ致病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒 马链球菌兽疫亚种C55138株，购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌基因工程菌株DH5α、大肠杆菌BL21、表达质粒pET-32a (+)均由广东省高校重点实验室保存。

1.2 主要试剂 RNA抽提试剂TRIZol，购自Invitrogen公司；DNase Ⅰ,购自Promega公司；Taq酶、限制性内切酶BamH Ⅰ和SalⅠ、T4连接酶、DNA Marker、反转录试剂盒及荧光定量PCR相关试剂，购自宝生物工程(大连)有限公司；UNIQ-10 柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒，购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 培养至对数生长期的SEZ作为体外培养细菌，感染小鼠体内细菌的富集方法按照Fu等描述的方法进行[6]。使用TRIZol试剂提取体内富集细菌和体外培养细菌的RNA，以Dnase Ⅰ去除DNA，反转录试剂盒进行反转录。以回收的PGK和16S rRNA扩增产物作为标准品，测定其浓度并换算至拷贝数/μL。对标准品做10倍梯度稀释，以其作为模板绘制标准曲线。PCR反应体系：上、下游引物各 0.5 μL，10×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水 11 μL，cDNA 样品 0.5 μL。每个样品做3个重复。PCR扩增条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃，5 s； 55 ℃，30 s，共40个循环。反应过程中的荧光信号由LightCycler 480实时荧光定量PCR仪检测[7-8]。

1.4 PGK基因的扩增 按NCBI报道的蛋白基因序列，通过分析序列获取抗原性较好的片段，利用Primer 5.0软件自行设计引物, 两端分别添加BamH 和SalI酶切位点及保护性碱基。P1：5′-TCGGATCCGTTGACTTTA-3′；P2：5′-CCTCCACCGTCGACTGAC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以CTAB法提取的SEZ基因组作为PCR模板，按下列顺序配制反应试剂。2.5 μL的10×Buffer，2.5 μL MgCl2，2.5 μL dNTP Mixtrue，10 μmol/L引物各0.5 μL，0.1μL的TaqDNA 聚合酶，2 μL DNA模板，加双蒸水至25 μL。扩增程序：95 ℃, 5 min； 95 ℃, 30 s；55 ℃, 30 s；72 ℃, 1 min；共30个循环，72 ℃再延伸5 min。

1.5 PCR产物的酶切、纯化和克隆 用BamH+SalI同时酶切PCR扩增的产物及pET-32a (+)，回收PCR片段以及载体片段。将回收 PCR片断与 pET-32a(+)连接，转化BL21感受态细胞。

1.6 重组质粒的诱导表达及纯化 将表达菌株接种于添加氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃摇床培养。取100 μL菌液接种于含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基中，于37 ℃培养，至OD600值达到0.6～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，继续培养3 h后收集菌体。利用填装有Ni-NTA 树脂(Qiagen GmbH, Germany)的蛋白纯化层析柱纯化重组蛋白PGK。

1.7 小鼠的免疫保护性试验 将成功表达并纯化的重组蛋白PGK与Marcol52佐剂乳化后作为疫苗，浓度为 200 μg/mL，设置佐剂对照(即用生理盐水与等量佐剂乳化制备)和空白对照(只注射生理盐水)。4周龄的雌性BALB/c小鼠(约18 g)每组10只，免疫方法如下：首免腹腔注射佐剂乳化的抗原0.5 mL，2周后腹腔免疫佐剂乳化的抗原 0.5 mL。二免10 d后采血测效价。剩余小鼠用于保护力试验，分别接种相同剂量的C55138(2×105CFU)，连续观察2周，记录小鼠的死亡情况。

2 结果与分析

2.1 Real-time PCR检测保护性抗原的体内诱导表达 为了探讨PGK是否在体内诱导增强表达的特性，体内感染细菌的 RNA和体外培养细菌的RNA进行了抽提，比较PGK在感染动物后其RNA含量是否显著增高。本试验采用 Real-time PCR技术研究PGK体内诱导表达特性。结果见图1，相对于体外培养的细菌，SEZ 感染小鼠脾脏分离细菌PGK的mRNA表达均显著上调，表明PGK属于体内诱导增强表达的抗原。

图1 荧光定量PCR分析PGK体内诱导表达

2.2 重组蛋白诱导的免疫反应 使用Ni-NTA树脂做亲和层析，纯化重组表达的PGK蛋白(融合His标签)，结果见图2。收集的目的蛋白使用超滤浓缩后，用于后续的试验分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠，二次免疫后第 10 天采血测试效价。结果见图3，重组PGK蛋白可以诱导高水平的IgG抗体。本试验使用羊抗鼠 IgG1-HRP、IgG2a-HRP 检测小鼠

图2 纯化重组PGK蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白Marker； 1：目的蛋白

血清抗体的 IgG1 和 IgG2a亚类来进一步评价抗原所诱导的免疫类型。小鼠血清中IgG1 和 IgG2a的水平可以从一定程度上反映出抗原所诱导的Th2和Th1型的免疫类型，表明PGK可诱导高水平的Th2和Th1型免疫应答。

2.3 PGK抗原的保护效力 为了评价PGK蛋白的保护效力，各组小鼠在二次免疫后第 10 天分别接种相同剂量的C55138(2×105CFU)，评价重组蛋白的免疫保护力。结果见图 4，空白对照组小鼠的死亡率为80%，阴性对照组小鼠的死亡率为70%，而试验组小鼠的死亡率仅为10%，表明PGK蛋白具有较高的保护效力。

图3 重组PGK蛋白诱导的免疫反应

A:重组蛋白免疫小鼠后的抗体水平； B:重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫类型

图4 重组PGK蛋白的保护效力

3 讨论

试验结果表明(见图4)，保护性抗原PGK免疫小鼠可以提供较高的保护效力。本试验进一步对PGK的保护机制进行了分析，PGK诱导产生特异性抗体，通过ELISA方法检测 IgG1和 IgG2a抗体，评价PGK在小鼠体内诱导的免疫类型，结果发现，PGK可诱导产生高滴度的IgG2a抗体，即诱导高水平的 Th1型免疫应答。宿主清除体内链球菌的感染主要是通过调理吞噬作用，而调理吞噬作用主要与Th1型免疫应答相关，因此PGK诱导产生Th1型免疫应答可能是其提供较高保护效力的作用机制。

病原菌侵入宿主后，立刻需要面对宿主体内的“恶劣”环境。为了应对这些环境，病原菌往往会迅速上调表达某些毒力相关因子[9]。因此，病原侵染宿主后，迅速上调表达可能是某些毒力因子的“特性”之一。本试验使用Real-time PCR技术探讨了新保护性抗原PGK在体内诱导表达的特性，发现其体内增强表达，暗示该蛋白在SEZ感染宿主过程中可能发挥重要作用[10]，有待通过构建PGK基因缺失突变菌株及回复突变菌株进一步阐明其作用机制。

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Identification and characterization of a protective antigen, PGK ofStreptococcusequissp.zooepidemicus

FU Qiang , LUO Hui-na , WANG Ai-fu , LI Gui-zhen , MA Chun-quan

(Foshan University, foshan 528231, China)

Streptococcusequissp.zooepidemicus(Streptococcuszooepidemicus, SEZ) is an important pathogen associated with opportunistic infections of pigs in China. The absence of suitable vaccine or virulence marker impeds the step of control SEZ infection. Phosphoglycerate kinase (PGK) has been identified as an immunogenic protein in the previous study but its protective efficacy is not clear. In the present study, the purified recombinant PGK could elicit a significant humoral antibody response and could confer significant protection against challenge with lethal dose of SEZ in mouse model. In addition, the PGK was an in vivo-induced antigen confirmed by the real-time PCR and could induce significant Th1-/Th2-immune responses. Our findings suggest that PGK plays an important role in the pathogenesis of SEZ and could be a target for the development of an effective vaccine against SEZ infection.

SEZ ; PGK ; antigen ; vaccine candidate ; pathogenesis Corresponding author：MA Chun-quan

2016-05-09

国家自然科学基金(31502047)；广东省自然科学基金项目(2014A030310020)；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目(2014KQNCX179)

付强(1983-)，男，讲师，博士，研究方向为临床兽医学与分子免疫学，E-mail：frankjohn.fu@hotmail.com

马春全，E-mail：machunquan@263.net

S858.28

A

0529-6005(2017)03-0026-03