机械活化法制备抑菌材料及其对草鱼的涂膜保鲜作用

何荣军,施俊妃,孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院,浙江 杭州 310014)

机械活化法制备抑菌材料及其对草鱼的涂膜保鲜作用

何荣军,施俊妃,孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院,浙江 杭州 310014)

通过机械活化法对淀粉和ε-聚赖氨酸的混合物进行球磨处理得到球磨共混物,利用扫描电子显微镜(SEM)、X-射线衍射仪(XRD)、差示扫描量热仪(DSC)、红外光谱仪(FTIR)等对其晶体结构、颗粒形貌、热特性和化学结构进行表征,并初步探讨了它对草鱼的涂膜保鲜效果.结果表明:在机械活化过程中,淀粉和ε-聚赖氨酸的晶体结构和颗粒形貌发生变化、粒径减小、结晶度下降、糊化温度降低,但是其化学结构没有改变.(4±1) ℃条件下对草鱼鱼肉进行涂膜处理,结果表明:球磨共混物涂膜处理组的挥发性盐基氮(TVB-N)和丙二醛(TBA)含量显著低于物理混合物涂膜处理组,可减缓pH的变化,并可使菌落总数指标在10 d之内不超过5 (lg CFU/g).这些结果表明,机械活化法制备抑菌膜材料在保鲜方面有潜在的应用价值.

淀粉;ε-聚赖氨酸;机械活化;性能表征;涂膜保鲜

塑料包装因其优越的机械性能被广泛应用于食品包装和保鲜领域,但是带来的环境污染问题迫使人们寻求能取代塑料制品的“绿色包装”材料.在众多的“绿色包装”材料中,可食性膜在近年来备受关注[1].探索具有良好成膜性能并且具有抑菌活性的膜材料已成为食品科技工业发展的一个重要方向,也是今后食品包装工业发展的主要趋势[2-3].

淀粉作为一种天然高分子材料[4],来源丰富,具有价格低廉、易生物降解、天然可再生等特点,是一种理想的绿色包装材料.但是由于淀粉具有较强的亲水性,容易滋生细菌等微生物,且其高晶结构致使淀粉基可食性膜的机械性能较差,这些缺点限制了淀粉在食品保鲜及食品包装行业的应用[5].因此,往往在淀粉中加入增塑剂[6]、抑菌剂[7-9]或对淀粉进行改性[10-12]来改善淀粉基可食性包装材料的性能.ε-聚赖氨酸是一种天然抑菌剂,具有广谱抑菌性,对酵母菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都具有显著的抑菌效果[13],并且其安全性和热稳定性良好,在食品保鲜中具有巨大的应用前景[14].机械活化(Mechanical activation),是指固体颗粒物质在摩擦、碰撞、冲击、剪切等机械力作用下,晶体结构及物化性能发生改变,部分机械能转变成物质的内能,从而引起固体的化学活性增加[15].机械活化法条件控制简单、绿色环保、安全高效.目前对机械活化在超微细化、纳米粉末、辅助提取技术、有机材料合成方面的研究日益广泛[16-18].本试验将淀粉及ε-聚赖氨酸充分混合,采用机械活化法对其进行球磨处理,制备一种具有抑菌活性的淀粉膜材料.为了深入掌握机械活化反应本质及淀粉与ε-聚赖氨酸在机械活化过程中的变化,本研究采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy, SEM)、X-射线衍射(X-Ray diffraction, XRD)、差示扫描量热仪(Differential scanning calorimetry, DSC)、红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)对球磨共混物(MASP)进行表征分析,并初步探讨其对草鱼涂膜保鲜的效果,进而为机械活化在变性淀粉领域上的应用提供理论和现实依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉(NS),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;ε-聚赖氨酸(ε-PL),浙江新银象生物工程有限公司;营养肉汤培养基,杭州微生物试剂有限公司;NaOH、EDTA、高氯酸、三氯乙酸、甲基红、次甲基蓝、硫代硫酸钠、硫酸、硫代巴比妥酸,国产分析纯,上海凌峰化学有限公司.

淀粉和ε-聚赖氨酸的物理混合物称为NSP,采用机械活化法球磨处理之后的产物称为MASP.

1.2 仪器与设备

自制球磨机(两个不锈钢球磨罐内径Φ为65 mm,高为50 mm,有效容积为166 mL,球磨介质为φ10 mm的不锈钢磨球).

VEGA 3 SBH台式钨灯丝扫描电子显微镜,捷克TESCAN公司;X’Pert PRO型X-射线衍射仪,荷兰Pnalytical公司;DSC-Q2000差示扫描量热仪,美国TA公司;Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪,美国热电尼高力公司;PHS-3C型数显酸度计,上海精科仪器有限公司;K9840自动凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司;UV 762紫外可见分光光度计,上海仪电分析仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 MASP的制备

将干燥的淀粉和ε-PL混合均匀,置于球磨罐中,加入球磨介质,在一定的球磨功率条件下进行球磨处理,一定时间后将产物与球磨介质分开,得到球磨共混物MASP,烘干,密封保存备用.

1.3.2 MASP的表征

1) 颗粒形貌观察.取适量样品用双面胶固定在样品台上喷金,使用TESCAN VEGA 3 SBH台式钨灯丝扫描电子显微镜观察MASP的颗粒形貌.

2) 晶体结构测定.采用X-射线衍射仪对MASP进行结晶结构的表征分析.测定条件:管电压40 kV;Cu靶;管电流40 mA;扫描范围2θ=10～40°;扫描速率:4 (°)/min.

3) 热特性测定.使用差示扫描量热仪对MASP在糊化过程中的热特性进行表征.测试方法:用样品铝盒称取约4.0 mg样品,按1∶4比例加入去离子水,密封后放置平衡4 h,以空盒作为参比,从30 ℃加热扫描至150 ℃;扫描速率10 ℃/min;样品室氮气流量30 mL/min.

4) 红外光谱测定.将1～2 mg MASP在红外灯辐射下与干燥的KBr粉末(1∶100)一起研细混匀,压片后用红外光谱仪进行测试,以NSP作对照,扫描范围400～4000 cm-1.

1.3.3 草鱼涂膜保鲜

1) 涂膜液的制备.将MASP和NSP分别制成30 g/L的淀粉糊液,其中,ε-PL的等价质量分数为0.1%,沸水浴糊化30 min,加入质量分数1.5%的甘油溶液,磁力搅拌1 min,真空脱气,冷却至室温备用.

2) 草鱼处理方法.选用新鲜草鱼在4 ℃的清水中暂养1～2 h,冰温放血后去头、尾、鳞和内脏,预冷水清洗干净后剔除鱼骨,分割成约3 cm×3 cm×2 cm左右的鱼块(25 g左右)备用.鱼块分别放入两种涂膜液中浸泡2 min,取出沥干后放入无菌培养皿上,分别标记为MASP组和NSP组,在清水中浸泡2 min的鱼块作为空白对照组,于(4±1) ℃培养箱中敞口贮藏10 d.每两天测定鱼肉的pH值、细菌总数、TVB-N值以及TBA值等品质指标,每次实验重复3次,取平均值,并分析不同处理组的差异.

3) 鲜度指标测定.① pH值的测定:鱼肉的pH值按照GB 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》进行测定.准确称取各组鱼肉5.00 g,绞碎后加入已灭菌的蒸馏水45 mL,搅拌后浸提30 min.过滤后取滤液测pH值,每个样品重复测定3次取平均值.② 细菌总数测定:鱼肉细菌总数的测定按照GB/T 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定.在无菌操作条件下准确称取各组鱼肉10.00 g,放入90 mL无菌生理盐水中,将肉搅碎,取1 mL匀浆液梯度稀释,选择3个合适的稀释梯度倾注平板,每个稀释度重复3次,30 ℃培养72 h,菌落(CFU)计数.③ TVB-N值的测定:TVB-N值的测定按照GB/T 9695.11—2008《肉与肉制品 氮含量测定》进行测定.准确称取绞碎的鱼肉5.00 g,加入45 mL浸提液(含0.6 mol/L高氯酸,4%三氯乙酸),用玻棒搅拌均匀,抽提60 min后过滤备用.滤液按照半微量定氮法测定.具体方法:25 mL锥形瓶中分别添加4%硼酸吸收液10 mL,混合指示剂2滴,30%氢氧化钠溶液5 mL,蒸馏水10 mL,蒸馏时间5 min,吸收液立即用新配0.01 mol/L硫酸标液滴定,重复3次取平均值.④ TBA值的测定:利用硫代巴比妥酸(TBA)法测定鱼肉中的丙二醛含量[19].准确称取碾碎的鱼肉5.00 g,加入45 mL已预冷的7.5% TCA溶液,匀浆2 min,4 ℃下抽提30 min,不时振荡,8 000 r/min离心10 min,取5 mL上清液和5 mL 0.02 mol/L TBA溶液混匀,于90 ℃水浴中反应40 min,流水冷却后,于532 nm处测定吸光度,根据标准曲线计算样品TBA值.

1.4 数据统计与整理

通过Origin 8.5数据处理软件进行绘图.方差分析使用SPSS 22.0 for Windows进行,显著性差异检验使用LSD检验法,P<0.05表示具有显著性差异.所有试验平行重复3次.

2 结果与分析

2.1 MASP表征分析

2.1.1 MASP扫描电镜分析

SEM是观察淀粉颗粒形貌发生变化的有效途径之一,可以分析产品的微观结构.采用扫描电子显微镜对NS和MASP的颗粒形貌进行初步检测分析,得到的SEM图如图1所示.与图1(a)NS相比,图1(b)中的MASP的颗粒结构发生了较大程度的变化.MASP颗粒表面粗糙,褶皱增加,部分颗粒的中部凹陷或者中空成扁平环状,部分颗粒周边粘连着许多结构不规则的小颗粒.由此可知,经过机械力的碰撞、摩擦、冲击和剪切作用[20],NS的颗粒结构受到较大程度的破坏,部分颗粒的粒径变小,使ε-PL更容易进入NS内部,增加了与NS之间的接触面积.

图1 NS和MASP的SEM图Fig.1 SEM patterns of NS and MASP

2.1.2 MASP的X-射线衍射分析

不同的结晶结构在X-射线衍射曲线上会出现不同的衍射特征峰.因此,X-射线衍射可以作为研究淀粉颗粒的结晶结构和结晶度的重要手段之一.NS和MASP的X-射线衍射曲线如图2所示.由图2(a)可见:NS属于典型的A型结晶结构,在2θ为15,17,18,23°处出现明显的晶体衍射峰[21].而MASP的衍射曲线中,衍射峰几乎消失,整条曲线变成一条具有馒头峰形的平缓曲线,在2θ为19°处附近有一弥散峰,主要表现弥散衍射特征,此时符合V型的结晶结构.说明在机械力的作用下,NS的晶体结构遭到严重破坏,淀粉颗粒的无定形程度增加,部分晶体结构已经转化为非晶体结构.

1—NS;2—MASP图2 NS与MASP的X-射线衍射图Fig.2 X-Ray diffraction patterns of NS and MASP

2.1.3 MASP热特性分析

NS和MASP在糊化过程中的DSC曲线如图3所示.由图3可见:NS在30～150 ℃存在两个吸热特征峰,两峰中处于低温的吸热峰(Peak 1)是因淀粉加热糊化发生了从多晶态到非晶态和从颗粒态到糊化态的双重物态转化引起.另一较高温度的吸热峰(Peak 2)的峰值温度为129.8 ℃,是由于加热升温过程中NS中的水分蒸发及链水结晶结构的破坏吸热而形成的.MASP的DSC曲线中,观察到糊化相变吸热峰消失,即已经达到糊化状态,MASP的晶体结构受到严重破坏,而peak 2的峰值温度增加到132.6 ℃,且强度有所增强,这是由于淀粉的结晶结构受到破坏,水分子易于渗入淀粉分子内部并结合所引起的[20].这个结果也证实了XRD和SEM的分析结果.

1—NS;2—MASP图3 NS与MASP的差示扫描量热图Fig.3 DSC of NS and MASP

2.1.4 MASP红外分析

红外光谱技术是鉴定化合物中分子组成和官能团结构的最有效手段之一.ε-PL,NS,NSP及MASP的红外吸收光谱图如图4所示.在ε-PL的红外谱图图4(a)中,3 442 cm-1处为NH2的非对称伸缩振动峰,2 930 cm-1处为C—H伸缩振动峰.1 562 cm-1处为NH键(酰胺Ⅱ),1 646 cm-1和1 538 cm-1处的峰为羰基伸缩振动峰(酰胺Ⅰ)和N—H弯曲振动峰.1 245 cm-1处的峰是酰胺键的C—N伸缩振动引起的.在NS的谱图图4(b)中,3 342 cm-1处为羟基的伸缩振动峰,1 649 cm-1处为结合水的羟基峰.763 cm-1到1 158 cm-1的峰指的是C—O伸缩振动吸收峰.

1—ε-PL;2—NS;3—NSP;4—MASP图4 ε-PL,NS,NSP和MASP的红外光谱图Fig.4 Infrared spectra of ε-PL, NS, NSP and MASP

MASP与NSP(图4(b))的红外谱图相比,谱图在氢键区、饱和碳氢键区、指纹区吸收峰的形状、位置基本保持不变.MASP谱图中,羰基(酰胺I)的伸缩振动峰从1 646 cm-1向高波数方向移动到1 770 cm-1处.说明在机械活化过程中,NS和ε-PL的化学结构没有发生根本改变,只是NS与ε-PL发生了分子间非共价相互作用[22].

2.2 草鱼鱼肉涂膜保鲜结果分析

2.2.1 细菌总数和pH变化

鱼肉的腐败主要是由微生物作用引起的,因此,细菌总数是反映鱼肉腐败程度和鲜度的重要指标之一.从图5(a)可知:在为期10 d的冷藏储藏期间,各组的菌落总数均呈上升趋势,而涂膜组的细菌总数增长相对缓慢,其中MASP处理组细菌总数增加速度最慢;NSP组在第8天时达到5.1(lg CFU/g),而MASP组在第10天仍未超过5(lg CFU/g).Huang等[23]的研究指出:鱼肉中菌落总数达到了5(lg CFU/g)即达到其可食用的上限.由此可见MASP组在贮藏中后期抑制细菌生长的效果显著优于NSP组(P<0.05).由图5(b)可知:冷藏鲜草鱼块贮藏期间pH值先下降后上升.冷鲜鱼肉在贮藏初期糖原酵解生成乳酸导致pH值下降,到贮藏中、后期,鱼体内源组织蛋白酶被释放出来,再加上微生物作用会导致水产品中蛋白质分解而产生氨及胺类等碱性挥发性物质,从而使pH值上升.

图5 冷藏过程中草鱼鱼肉细菌总数及pH值变化Fig.5 Changes of total bacteria counts and pH in grass carp during cold storage

2.2.2 草鱼TVB-N和TBA质量分数的变化

TVB-N是蛋白质在内源酶和细菌的共同作用下分解产生的氨以及胺类等碱性含氮物质,通常是鱼类腐败初期的重要评价指标[24].由图6(a)可见:草鱼鱼肉在贮藏过程中TVB-N质量分数逐渐上升.根据GB 2733—2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》,淡水鱼食用标准TVB-N≤200 mg/kg.涂膜处理明显延缓了草鱼块冷藏期间TVB-N质量分数的增加,其中MASP涂膜处理组效果最好,并且显著优于NSP组(P<0.05).NSP组在第8天时TVB-N质量分数为214.5 mg/kg,而MASP组在第10天时仍处于可食用范围.

图6 冷藏过程中草鱼鱼肉TVB-N及TBA值变化Fig.6 Changes of TVB-N and TBA value in grass carp during cold storage

脂类食品中不饱和脂肪酸氧化降解产物丙二醛能与TBA试剂反应生成稳定的红色化合物,该物质在530 nm处有最大吸收峰值,利用该性质测定TBA值.使用TBA值反映鱼肉脂肪的氧化酸败程度,TBA值越大,鱼类脂肪的最终氧化程度越高.由图6(b)看出:草鱼鱼块冷藏期间TBA含量呈现上升趋势,对照组尤为明显,10 d时的TBA含量是0 d时的4.45倍.涂膜处理组TBA值增加得相对缓慢,与TVB-N的变化趋势类似,MASP组的效果显著优于NSP组(P<0.05).

3 结 论

鱼肉的腐败是一个复杂的变化过程,其中微生物的大量繁殖是最主要的原因,因此抑菌成为鱼类保鲜的研究热点.对冷鲜鱼块进行涂膜处理,结果显示:MASP涂膜不仅能有效延缓pH的变化,抑制TVB-N和TBA值的上升,还能显著抑制细菌的生长.冷鲜鱼块贮藏10 d后,MASP组的各项鲜度指标均达到食用标准,并显著优于NSP组.MASP的涂膜保鲜效果显著提高的原因是由于机械活化作用有效破坏了淀粉致密的颗粒表面和结晶结构,淀粉从多晶态转变为非晶态,糊化温度降低,粒径减小,与ε-PL的接触面积增大,分子间相互作用增强,从而使MASP涂膜更加致密,其阻隔性能和抑菌性能显著提高.本文研究了机械活化过程中膜材料的结构变化和涂膜保鲜效果,展现出机械活化技术在淀粉改性方面的巨大研究发展空间,为机械活化技术应用到食品包装保鲜方面提供了现实意义.

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(责任编辑：朱小惠)

Preparation of antibacterial coating materials by mechanical activation method and preservation of grass carp

HE Rongjun, SHI Junfei, SUN Peilong

(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

At the solvent-free and external agents-free condition, the mixture of starch and ε-Poly-L-lysine (NSP) was mechanically treated by the technology of mechanical activation method with a ball mill, and the product was named MASP. The effect of ball milling treatment on the morphology, crystal structure and molecular groups of starch was explored by scanning electron microscopy (SEM), X-Ray diffraction (XRD), differential scanning calorimetry (DSC) and fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The films of MASP were covered on grass carp. The preserving quality of grass carp during cold storage (4±1) ℃ was assessed. The results indicated that during the preparation process, the particle morphology and crystallization of starch were destroyed, but the chemical structure of starch and ε-Poly-L-lysine was almost not changed. The contents of volatile base nitrogen (TVB-N) and malondialdehyde (TBA) of the MASP coating treatment group were significantly lower than those of the NSP coating treatment group, slowed down the rate of change, meanwhile the total number of colonies didn’t exceed 5 (lg CFU/g) within 10 days. These results indicated that the preparation of antibacterial coating materials by mechanical activation method has potential application value in preservation.

starch; ε-Poly-L-lysine; mechanical activation; performance characterization; film-coating preservation

2017-02-17

浙江省自然科学基金资助项目(LY12H28007)

何荣军(1978—),男,浙江龙泉人,副教授,硕士,研究方向为食品化学,E-mail:hrjun@zuju.edu.cn.

TS205.9

A

1674-2214(2017)01-0030-06