侯氏黑散化学成分对脂多糖诱导BV2细胞活化中炎性反应因子分泌平衡的影响

常佳慧 赵 晖 王 蕾 张 弛 陆 跃 张秋霞*

(1.首都医科大学中医药学院 中医络病研究北京市重点实验室， 北京 100069；2.北京中医药大学期刊中心， 北京 100029)

·基础研究 ·

侯氏黑散化学成分对脂多糖诱导BV2细胞活化中炎性反应因子分泌平衡的影响

常佳慧1赵 晖1王 蕾1张 弛2陆 跃1张秋霞1*

(1.首都医科大学中医药学院 中医络病研究北京市重点实验室， 北京 100069；2.北京中医药大学期刊中心， 北京 100029)

目的 探究侯氏黑散方中绿原酸(chlorogenic acid，CGA)、木犀草苷(cynaroside，CYN)、木犀草素(luteolin，LUT)、人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GS-Rg1)对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导小胶质细胞炎性反应因子表达的影响。方法 实验分对照组、模型组、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理组。利用LPS诱导BV2细胞过度活化，建立脑缺血后小胶质细胞炎性反应损伤体外模型；CCK-8法检测各组细胞活性；Griess法检测各组细胞上清中一氧化氮(nitric oxide，NO)的量；酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的量；蛋白印迹法(Western blotting, WB)检测各组细胞p-p65、p-IκBα蛋白表达。结果 与模型组相比，不影响细胞生存活性的情况下，CGA、CYN、LUT、GS-Rg1可显著降低细胞上清中促炎因子NO、TNF-α、IL-6浓度；GS-Rg1可显著升高抑炎因子IL-10、TGF-β1浓度；CGA、CYN、LUT、GS-Rg1可显著降低细胞中p-p65、p-IκBα蛋白浓度。结论 CGA、CYN、LUT、GS-Rg1分别从促炎、抑炎两方面调节脑缺血后炎性反应相关因子分泌的平衡，其机制与核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路活化有关。

侯氏黑散；绿原酸；木犀草苷；木犀草素；人参皂苷Rg1；小胶质细胞；炎性反应因子；NF-κB信号通路

脑缺血是高发病率、高致残率及高病死率的常见病，其造成的家庭负担、社会危害不容忽视。炎性反应作为脑缺血的主要损伤机制之一，可与其他各种机制相互作用，共同造成神经损伤。炎性细胞因子是脑缺血损伤发病机制中的关键介质，脑缺血后不同作用的炎性反应因子可直接或间接参与炎性反应细胞的活化和浸润，并在神经元的损伤与修复过程中起到重要作用[1]。促炎因子可促进炎性反应细胞浸润，导致水肿形成，参与大脑损伤的反应过程；抑炎因子可通过抑制缺血期中枢神经系统的炎性反应，减轻脑水肿，减少梗死面积，发挥神经保护作用[2]。已有实验[3]表明，大脑中动脉栓塞大鼠局灶缺血区可见反应性小胶质细胞，缺血再灌注损伤后缺血中心区内充满小胶质细胞，因而进一步探究炎性反应因子在脑缺血损伤中的作用，对该病的防治具有重要意义。

侯氏黑散方出自《金匮要略·中风历节》篇。作为仲景治疗卒中第一方，本方在组方用药上充分体现了风药佐助补虚药“补不足，损有余”的立法思想。本团队前期采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对其化学成分进行分析[4]，通过体内实验已证实侯氏黑散可保护和修复缺血性脑损伤，促进神经再生[5-11]。在此基础上，本实验选取侯氏黑散方中风药代表药物菊花中绿原酸(chlorogenic acid，CGA)、木犀草苷(cynaroside，CYN)、木犀草素(luteolin，LUT)及补虚药代表药物人参中人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1，GS-Rg1)，通过体外实验，观察风药、补虚药有效成分单体对小胶质细胞过度活化后炎性反应相关细胞因子一氧化氮(nitric oxide，NO)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的影响，以及对核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路的激活，探讨风药、补虚药对脑缺血后炎性反应的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

小鼠小胶质细胞株BV2，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.1.2 药品及试剂

脂多糖(美国Sigma公司L880)；绿原酸(MUST-16031610)，木犀草苷(MUST-16012405)，木犀草素(MUST-15021005)，人参皂苷Rg1(MUST-15042215)，纯度均≥98%，购自成都曼斯特公司；DMEM(美国Corning公司11330-032)；胎牛血清、青霉素-链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；细胞增生-毒性检测试剂盒(日本Dojindo公司)；NO检测试剂盒(上海碧云天生物有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司；p-p65、p-IκB(abcam)、β-actin抗体购自北京欣博盛科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

超净生物安全柜(新加坡ESCD公司)；二氧化碳培养箱、超低温冰箱(美国Thermo scientific公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；电泳仪、电转仪(美国Bio-rad公司)；微孔板检测系统(美国Molecular Devices公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

BV2细胞置于含10%(体积分数)灭活胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃，5% (体积分数)CO2+95% (体积分数) 空气，饱和湿度条件的CO2培养箱中培养，每2 d换液1次。待细胞至80%融合时传代：弃旧培养基，PBS清洗2次后加入0.25%(质量分数)胰蛋白酶适度消化，镜下见大部分细胞圆缩，间隙增大时，立即加入含血清培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜含血清培养基重悬所收集细胞，制成单细胞悬液，适宜密度接种于新培养瓶，取状态稳定的对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 LPS诱导BV2活化损伤模型建立及分组处理

取对数生长期BV2细胞，消化计数，调整细胞密度，按1.5×105/孔接种于6孔培养板，采用数字表法随机分为正常对照组(CON)、炎性反应模型组(MOD)、GS-Rg1处理组(GS-Rg1)、LUT处理组(LUT)、CYN处理组(CYN)、CGA处理组(CGA)。各组BV2细胞正常条件培养24 h贴壁后，弃旧液，对照组加无血清新鲜培养基，GS-Rg1处理组、LUT处理组、CYN处理组、CGA处理组分别加入含10 μmol/L GS-Rg1、含30 μmol/L LUT、200 μmol/L CYN、200 μmol/L CGA的无血清培养基，预处理2 h；弃旧液，对照组加入无血清新鲜培养基，模型组及药物处理组分别加入含0.1 μg/mL LPS的无血清培养基，正常条件下诱导活化24 h，收集细胞及上清液用于后续实验。

1.2.3 细胞活性检测

细胞以3×104/孔接种于96孔培养板，设5组分别给予LPS、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理后，吸弃培养液，加入含10%(体积分数)CCK8的新鲜培养液，100 μL/孔，37 ℃孵育4 h，酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度(A值)，结果以百分比(%)表示。细胞存活率(%)=实验组A值/CON组A值×100%。

1.2.4 细胞上清液NO检测

细胞以1.5×105/孔接种于6孔培养板，给予相应处理后收集各组细胞上清液，于96孔板中依次加入50 μL/孔的标准品或待测样品、Griess试剂Ⅰ和Ⅱ，室温孵育5 min，酶标仪测定540 nm处A值，根据标准曲线计算NO量，结果以μmol/L表示。

1.2.5 细胞上清液炎性反应因子检测

细胞以1.5×105/孔接种于6孔培养板，给予相应处理后收集各组细胞上清液，ELISA试剂盒于室温平衡20 min，按照说明书步骤进行操作。酶标仪测定450 nm处A值，以A值为纵坐标，标准品浓度为横坐标拟合标准曲线，根据标准曲线计算各组炎性反应因子相应浓度，结果以pg/mL表示。

1.2.6 细胞p-p65、p-IKBα蛋白检测

细胞以1.5×105/孔接种于6孔培养板，给予相应处理后收集各组细胞，冰上裂解约20 min，4 ℃下12 000g离心15 min，BCA法蛋白定量。各组取等量蛋白样品进行10%(质量分数)SDS-PAGE电泳，采用湿转法50 min将蛋白转移至PVDF膜，5%(质量分数)BSA 37 ℃封闭2 h，分别加入p-p65(兔源， 1∶10 000)、p-IκBα(小鼠源，1∶1 000)和β-actin一抗(小鼠源，1∶20 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5×5 min后，对应加入羊抗兔和羊抗小鼠二抗(IgG/HRP，1∶20 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5×5 min，ECL发光液反应后于暗室进行曝光显影定影处理。采用Image J图像分析系统测定蛋白质条带灰度值，结果以目的条带与内参条带(β-actin)的比值表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 LPS、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对BV2细胞存活率的影响

与正常组相比，LPS、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理组BV2细胞活性差异均无统计学意义(P>0.05)，表明不同浓度LPS、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理24 h均无明显细胞毒性作用(图1)。

图1 LPS、CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对BV2细胞存活率的影响

CON: control; LPS:lipopolysaccharide; CGA:chlorogenic acid; CYN:cynaroside; LUT:luteolin; GS-Rg1:ginsenoside Rg1.

2.2 CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对LPS损伤BV2细胞NO释放的影响

与正常组相比，模型组细胞上清液NO量明显增高；与模型组相比，CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理组可显著降低细胞上清液NO量，差异有统计学意义(P<0.001)(图2)。

图2 CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对LPS损伤BV2细胞NO释放的影响

2.3 CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对LPS损伤BV2细胞炎性反应因子分泌的影响

与正常组相比，模型组细胞上清液TNF-α、IL-6浓度明显增高；与模型组相比，CGA、CYN、LUT、GS-Rg1处理组可显著降低细胞上清液TNF-α、IL-6浓度，差异有统计学意义(P<0.001)(图3A、B)；与正常组相比，模型组细胞上清液IL-10浓度明显降低；与模型组相比，CGA、LUT、GS-Rg1处理组可显著升高细胞上清液IL-10浓度，差异有统计学意义(P<0.001)(图3C)；与正常组相比，模型组细胞上清液TGF-β1浓度明显增高；与模型组相比，CGA、CYN、LUT处理组可显著降低细胞上清液TGF-β1浓度，GS-Rg1处理组可显著升高细胞上清液TGF-β1浓度，差异有统计学意义(P<0.001)(图3D)。

图3 CGA、CYN、LUT、GS-Rg1对LPS损伤BV2细胞上清液炎性反应因子分泌的影响

2.4 LUT、GS-Rg1、CYN、CGA对LPS损伤BV2细胞NF-kB通路活化的影响

与正常组相比，模型组细胞p-p65、p-IKBα表达明显增高；与模型组相比，LUT、GS-Rg1、CYN、CGA处理组可显著降低细胞p-p65、p-IκBα表达，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(图4)。

3 讨论

本实验证实了侯氏黑散方中风药、补虚药化学成分单体可调节脑缺血后炎性反应，促进脑缺血后神经血管单元内环境稳态的恢复。实验结果表明CGA、CYN、LUT和GS-Rg1分别从促炎、抑炎两方面调节小胶质细胞NO、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β1分泌的平衡，其机制与NF-κB通路活化有关。

小胶质细胞是脑实质中最主要的免疫细胞。脑缺血后，活化的小胶质细胞能显著上调许多细胞因子的分泌水平，这些物质中某些能吞噬死亡的神经元，促进修复，发挥神经保护作用[12]，某些可发挥促炎、细胞毒性等功能，进而导致神经元死亡[13]。调节小胶质细胞活化和炎性反应，平衡其所释放神经毒性因子跟神经保护因子是其功能稳定的关键。

NO是神经系统中重要的神经递质，同时又是一种高反应性、细胞毒性的自由基，可自由穿透细胞膜，作用于细胞内的靶分子发挥作用。研究[14]表明，脑缺血后24 h内NO产生活跃，且主要表现在内皮细胞和小胶质细胞。过量的NO可介导并放大炎性反应级联反应等，最终导致神经元凋亡和坏死，进一步加重脑损伤[15]。已有研究[16-18]表明，木犀草素、绿原酸、人参皂苷Rg1等可有效抑制LPS刺激BV2细胞后NO产生，本实验同样证实了绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷Rg1可显著减少细胞上清中炎性反应介质NO的产生。

图4 LUT、GS-Rg1、CYN、CGA对LPS损伤BV2细胞NF-κB通路活化的影响

TNF-α是一种由细胞分泌的前炎性反应细胞因子，参与机体的免疫应答和炎性反应，可诱导IL-6、IL-8等因子的mRNA转录及表达，起协同致炎作用。可作为缺血性脑卒中的标志物，用于脑缺血病人早期诊断[19]。IL-6作为经典的炎性反应因子，在神经组织的生理稳态以及炎性反应性疾病的发病机制中均发挥重要作用，其病理机制可能与诱导最初的炎性反应免疫瀑布发生及诱导趋化因子的表达有关，可由小胶质细胞分泌[20]。已有研究[21]证实，脑梗死急性期IL-6明显增高，可引起小鼠神经元损伤，关于卒中病人的前瞻性研究[22]也表明IL-6浓度升高与预后不良关系密切[23]。前期研究[24]表明，侯氏黑散及其方中风药可减少脑缺血大鼠纹状体中炎性反应因子如IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达，反映风药在炎性反应控制方面的优势。本实验结果进一步揭示了侯氏黑散中化学成分绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷Rg1可显著减少LPS刺激BV2细胞上清液中促炎因子TNF-α、IL-6浓度，从而减轻脑缺血后炎性反应损伤。

IL-10可通过抑制多种促炎细胞因子的产生，阻止炎性反应级联反应，在减轻炎性反应损害方面发挥重要作用[25-26]。一项关于成人小胶质细胞的研究[27]表明，其极化时吞噬活性和IL-10表达均高于巨噬细胞，表明小胶质细胞在促炎的环境下也能表现出抗炎作用，对神经保护具有重要意义。TGF-β1是一种多功能蛋白质，通过结合并激活细胞表面的TGF-β1受体，影响多种细胞的生长、分化、凋亡及免疫调节等功能。脑缺血后小胶质细胞分泌的TGF-β1可促进增生，调节炎性反应从而发挥神经保护作用[13,28]。另外，也有研究[29]表明，TGF-β1可抑制谷氨酰胺酶活性，致使谷氨酸盐堆积，毒性增加，加重缺血性神经元的损害。前期实验[30]表明，侯氏黑散给药14 d可促进MCAO大鼠大脑皮质TGF-β1表达，保护和修复缺血性脑损伤。本实验结果显示，LPS刺激BV2细胞上清液TGF-β1浓度明显增高，绿原酸、木犀草苷、木犀草素处理组可显著降低细胞上清液TGF-β1浓度，人参皂苷Rg1处理组可显著升高细胞上清液TGF-β1浓度，表明风药、补虚药中化学成分对TGF-β1的调节各有偏重，其保护与损伤作用或与不同时间节点有关，具体机制仍需更深入的探究。

为进一步探明侯氏黑散化学成分抑制LPS刺激BV2细胞炎性反应的作用机制，本实验又进一步研究了炎性反应相关的NF-κB信号通路。NF-κB激活是脑缺血后炎性反应发挥损伤作用的基础。作为炎性反应过程中一个重要的转录因子，一般状态下，NF-κB与其抑制蛋白(IκBs)结合形成三聚体，以无活性状态滞留于细胞质内[31]。脑缺血后，该通路被激活，与NF-κB结合的IκB磷酸化、泛素化并被蛋白酶体降解，释放p50/p65入核，促进多种炎性反应介质的表达[32]。因而许多抗炎治疗手段与抑制NF-κB信号通路有关。研究[16,33]表明，木犀草素作为一个有效的抗炎药物及潜在神经保护剂，可通过减少iNOS表达抑制LPS刺激BV2细胞后促炎介质NO、TNF-α的产生，其抗炎作用机制与抑制LPS诱导的NF-κB转录活化有关。本实验结果表明，绿原酸、木犀草苷、木犀草素、人参皂苷Rg1可通过降低细胞中p-p65、p-IκBα蛋白水平，抑制NF-κB通路活化从而发挥保护作用。因此，进一步研究脑缺血后炎性反应介质的作用机制，通过药物促进其神经元保护作用而拮抗其致炎效应，对脑缺血的防治具有重要指导意义。另外，对侯氏黑散方中多成分及其相互间的作用仍需进一步探索。

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编辑 陈瑞芳

Effects of chemical components of HSHS on the balance of inflammatory cytokines in LPS-stimulated BV2 cells

Chang Jiahui1, Zhao Hui1, Wang Lei1, Zhang Chi2, Lu Yue1, Zhang Qiuxia1*

(1.CollateralDiseaseResearchUnit,TCMSchool,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.JournalCenter,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective To investigate the influence of chlorogenic acid, cynaroside, luteolin, ginsenoside Rg1 on expression of inflammatory cytokines. Methods The experiment was divided into six groups: control, model, chlorogenic acid, cynaroside, luteolin and ginsenoside Rg1 groups. The mimic ischemia injured microglia model was induced by LPS. The cyto-activity was detected via cell count kit. The NO content was determined by Griess Reagent. Contents of TNF-α、IL-6、IL-10 and TGF-β1were detected by ELISA.The expression levels of p-p65 and p-IκBα were detected by Western blotting. Results Compared with those results of model group, chlorogenic acid, cynaroside, luteolin and ginsenoside Rg1 groups could significantly inhibit the release of NO, and decrease the content of TNF-α and IL-6, ginsenoside Rg1 markedly elevated the TGF-β1level without influencing the cell survival. Chlorogenic acid, cynaroside, luteolin and ginsenoside Rg1 groups could decrease the expression of p-p65, p-IκBα. Conclusion The findings demonstrated that chlorogenic acid, cynaroside, luteolin and ginsenoside Rg1 played regulating roles in balancing ischemia injured microglia homeostasis via promoting anti-inflammatory cytokines as well as inhibiting the inflammatory cytokines. The therapeutic roles in the inflammatory reaction of cerebral ischemia which perhaps worked through the activation of NF-κB signaling pathway.

Houshiheisan; chlorogenic acid; cynaroside; luteolin; ginsenoside Rg1; microglia; inflammatory cytokines; NF-κB signaling pathway

国家自然科学基金(81373526)，北京市自然科学基金(7102014, 7122018)，北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划-长城学者(CIT&TCD20140329)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81373526), Natural Science Foundation of Beijing (7102014, 7122018), Program for Changcheng Scholars of the Importation and Development of High-Caliber Talents Project of Beijing Municipal Institutions (CIT&TCD20140329).

时间：2017-04-13 20∶01

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2001.044.html-

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.013]

R289.5

2016-12-06)

*Corresponding author， E-mail：zqx26@ 163.com