新型两亲性二肽分子的合成与表征

陈 平, 王 翔, 支三军, 韦长梅

(淮阴师范学院 化学化工学院 江苏省低维材料化学重点建设实验室, 江苏 淮安 223300)

新型两亲性二肽分子的合成与表征

陈 平, 王 翔, 支三军, 韦长梅

(淮阴师范学院 化学化工学院 江苏省低维材料化学重点建设实验室, 江苏 淮安 223300)

通过多肽液相合成的方法,利用氨基与活化酯在水与四氢呋喃混合溶剂中进行反应,高产率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．同时基于该二肽结构中棕榈酸分子端位疏水性的烃基链与谷氨酸侧基二聚乙二醇单甲醚链段的亲水性,制备得到了一种新型的具有两亲性的二肽分子,并对其结构与性质进行了研究．

多肽液相合成; 两亲性二肽分子; 谷氨酸

0 引言

多肽类药物及基于多肽的生物医用材料,在各类疾病的治疗过程中具有非常广泛的应用[1]．但是由离子型氨基酸形成的多肽药物分子,其溶解性往往会受到环境pH、盐浓度等因素的影响,并且这些由离子型氨基酸组成的完全亲水性的多肽药物及载体,往往很难透过疏水性的细胞膜被机体所吸收[2]．而两亲性分子可以在亲水性与亲油性之间找到一个平衡点,类似于表面活性剂或脂质体的性质,使具有两亲性结构的多肽分子可以在水溶液中自组装形成多样性的结构,从而提高多肽类药物的生物利用度[3-4]．同时,离子型多肽分子往往还会导致生物体内带相反电荷生物分子的聚沉,引起生物毒性效应,从而限制了该类多肽分子的应用．利用合成得到的侧链为寡聚乙二醇功能化的谷氨酸衍生物,这种侧基为非离子型结构的氨基酸,由于其寡聚乙二醇侧链的溶解性具有温度响应性,因此该新型氨基酸单体也被用于制备温度响应性的聚多肽[5]和构建多肽水凝胶体系[6]的研究中．但是这些通过开环聚合方法得到的聚多肽结构,通常不具有确定的、单一的分子量,其分子量分布在某一范围内,并且聚多肽合成过程的条件一般较为苛刻,需要在无水、无氧且聚合单体纯度较高的条件下,才能合成出分子量分布较窄的聚多肽结构．

本文基于多肽液相合成的方法,不需要对氨基酸单体进行化学修饰保护,在四氢呋喃与水的混合溶剂中,能够高产率地合成出谷氨酸二肽分子衍生物．并且在该二肽分子的端位上引入了一段疏水性的烃基链段,同时利用氨基酸侧链寡聚乙二醇链段的温度响应性,合成出了一种新型的具有两亲性的二肽分子．

1 实验部分

1.1 材料与主要试剂

L-谷氨酸(上海吉尔生化,99%),N,N′-二环己基碳二亚胺(DCC,上海吉尔生化,99%),N-羟基丁二酰亚胺(阿拉丁试剂,NHS,99%),4-二甲氨基吡啶(阿拉丁,DMAP,99%),棕榈酸(阿法埃莎试剂,Pal,99%)购买后未经进一步纯化直接使用．四氢呋喃(THF)经高纯氮鼓泡除氧再利用活性氧化铝柱干燥后使用．去离子水(电阻率>18 MΩ·cm-1)通过Millipore Milli-Q纯化系统获得．1H-NMR使用Bruker AV400 FT-NMR核磁共振仪测定．

1.2 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

在烧瓶中加入25 mL二乙二醇单甲醚,搅拌下加入5 g谷氨酸,形成白色悬浊液,于0℃冰水浴中缓慢滴加3 mL浓硫酸,滴加完毕后缓慢升温至室温,在室温下搅拌过夜．反应结束后溶液变澄清,将其缓慢滴加到三乙胺(12 mL)的异丙醇(48 mL)溶液中产生白色沉淀,经离心分离得到白色固体,用过量的异丙醇洗涤2次,经真空干燥后最终得到L-EG2-Glu,产率为48%．1H-NMR(400 MHz,D2O):δ4.31-4.22(t,2H),3.82-3.72(m,3H),3.72-3.64(m,2H),3.63-3.56(m,2H),3.39-3.32(s,3H),2.66-2.49(m,2H),2.25-2.07(m,2H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C10H19NO6,250.1;found 250.1.

图1 γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)的合成

1.3 棕榈酸活化酯(Pal-NHS)的合成

如图2所示,取棕榈酸(4.0 g),1.1倍当量的N,N′-二环己基碳二亚胺(3.540 g),1.05倍当量的N-羟基丁二酰亚胺(1.885 g),0.01倍当量的DMAP(0.019 g),无水四氢呋喃约30 mL,冰水浴中反应5 min后,溶液变成乳白色,有大量不溶物N,N′-二环乙基脲(DCU)产生．反应过夜后,置于4℃冰箱约1 h后,过滤除去大部分的DCU．再将滤液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的2/3后,再于4℃放置约4 h,过滤除去析出的DCU．继续浓缩至原体积的1/3, 于4℃放置后,进一步过滤除去残留的DCU．最后旋蒸浓缩后得到产物Pal-NHS,产率为90%．

图2 Pal-NHS的合成

1.4 棕榈酸-γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸(Pal-EG2-Glu)的合成

首先取1.0 g Pal-NHS,溶解于10 mL THF中,然后取1.2倍当量的L-EG2-Glu(0.846 g),2.4倍当量的NaHCO3(0.570 g),加10 mL水,调节溶液pH至10左右,使L-EG2-Glu完全溶解．在冰水浴中,将谷氨酸的水溶液缓慢滴加至上述THF溶液中,反应约5 h后,用旋转蒸发仪除去反应体系中大部分的THF,再用乙酸乙酯/盐酸(1:1v/v)水溶液反复萃取3次．有机相用无水硫酸镁干燥后,过滤蒸干得到Pal-EG2-Glu,产率为86%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.64-4.50(m,1H),4.36-4.16(m,2H),3.70-3.67(t,2H),3.66-3.62(m,2H),3.60-3.57(m,2H),3.40(s,3H),2.57-2.38(m,2H),2.28-1.69(m,4H),1.63-1.58(m,2H),1.28-1.24(m,24H),0.89-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+Na]+Calcd C26H49NO7Na,510.4;found 510.4.

图3 Pal-EG2-Glu的合成

1.5 棕榈酸-(γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-L-谷氨酸)2二肽(Pal-(EG2-Glu)2)的合成

取0.8 g Pal-EG2-Glu溶解于15 mL四氢呋喃中,然后如前述方法,依次加入相应量的DCC、NHS和DMAP,在冰水浴中反应30 min后,再于常温下反应3 h,过滤除去产生的DCU,后经多次浓缩,并于4℃冷却进一步除去残留的DCU,得到连接有活化酯的谷氨酸Pal-EG2-Glu-NHS．将该产物溶解于10 mL THF,按前述方法,将相应摩尔比例的L-EG2-Glu溶解于NaHCO3水溶液中,然后在冰水浴中缓慢滴加到Pal-EG2-Glu-NHS的THF溶液中,反应过夜后,经萃取、干燥、旋蒸后得到最终的产物,产率为83%．1H-NMR(400 MHz,CDCl3):δ4.62-4.53(m,2H),4.31-4.20(m,4H),3.72-3.69(t,4H),3.66-3.64(m,4H),3.61-3.57(m,4H),3.40-3.39(d,6H),2.48-2.39(m,4H),2.27-1.70(m,6H),1.62-1.60(m,2H),1.28-1.25(m,24H),0.90-0.86(t,3H);ESI-MS(m/z)[M+H]+Calcd C36H67N2O12,719.5;found 719.5.

图4 Pal-(EG2-Glu)2的合成

2 结果与讨论

根据文献报道的方法[5],将二聚乙二醇单甲醚与谷氨酸在浓硫酸催化的条件下发生酯化反应,制备得到γ-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)酯-左旋-谷氨酸(L-EG2-Glu)．由于寡聚乙二醇链段在水溶液中的溶解性具有温度依赖性,从而在谷氨酸的侧链上引入了具有温度响应性的功能基团．

棕榈酸是一种天然的饱和脂肪酸,常以甘油酯的形式普遍存在于动植物的油脂中,棕榈酸中含有的十六个碳的烃基链是具有良好疏水性能的链段. 选择将棕榈酸作为两亲性多肽结构中的疏水性端基的合成策略具有原料易得且生物相容性较好等优点．

基于多肽液相合成方法利用棕榈酸端位羧基与N-羟基丁二酰亚胺反应制备活化酯的方法将其端位活化,具有操作简单、易于纯化并能在偶联过程中保持氨基酸原有手性中心活性等特点．该酯化过程中,以DCC为脱水试剂、DMAP作为碱性催化剂,反应后经多次浓缩、冷却过滤除去副产物DCU,从而高产率地制备出棕榈酸端基连接有活化酯的结构(Pal-NHS)．

将合成得到的谷氨酸L-EG2-Glu溶解于NaHCO3的水溶液中,从而使谷氨酸中的羧基保持离子化的水溶性状态、游离的氨基保持较强的亲核性能．然后在冰水浴中,将上述谷氨酸的水溶液缓慢滴加至溶解有Pal-NHS的THF溶液中,利用氨基与活化酯的特异性反应,经洗涤、干燥后,成功合成得到了以疏水性棕榈酸烷基为端基、温敏性二聚乙二醇单甲醚为侧链的谷氨酸Pal-EG2-Glu．该产物的1H-NMR(图5-A)表征结果表明,在化学位移1～2的范围内出现棕榈酸亚甲基的特征峰,同时氨基酸侧链中二聚乙二醇单甲醚的亚甲基的吸收峰出现在化学位移3～4区域内,证明通过氨基与活化酯的反应,可以高效地制备以棕榈酸为端基、二聚乙二醇单甲醚为侧链的谷氨酸衍生物．通过类似的方法,我们进一步利用Pal-EG2-Glu端位的羧基,也是先将其制备成活化酯的结构,然后与Pal-EG2-Glu在THF/NaHCO3的混合溶剂中反应后,最终高产率地制备得到二肽Pal-(EG2-Glu)2．该二肽分子的核磁表征的结果如图5-B所示,可以看到,在核磁氢谱的相应化学位移处具有端位棕榈酸与侧基中乙二醇的亚甲基的相应吸收峰,并且相应的积分面积也与该分子结构中氢的数目相对应,质谱的表征结果也进一步确认了该二肽分子的结构．

图5 Pal-EG2-Glu(A)和Pal-(EG2-Glu)2(B)的核磁氢谱

在成功合成得到了侧链为二聚乙二醇单甲醚、端基为棕榈酸烃基链的二肽结构以后,对该两亲性分子的溶解行为进行了研究．在室温20℃左右的温度条件下,二肽分子侧链中的二聚乙二醇单甲醚结构具有很好的水溶性,将该二肽分子溶于水后可以形成澄清的透明溶液．通过芘荧光探针方法的研究，表明该两亲性二肽分子在20℃的水溶液中可能是以类似胶束的聚集状态存在,其中聚集形貌与聚集机理将在后续研究中进行．由于谷氨酸侧链上的二聚乙二醇单甲醚链段的溶解性具有温度响应性,当将该二肽水溶液加热到40℃以上时,氨基酸侧链转变成疏水性的结构,从而使该二肽分子由原来具有疏水性端基与亲水性侧链的两亲性结构,转变成完全疏水性的分子结构,这也使其从水溶液中沉淀出来．因此，基于该二肽分子的溶解性质与溶液自组装行为,有望将其应用于药物的负载与温控释放的研究中．

3 结论

通过液相合成的方法,利用氨基与活化酯的反应,合成得到了以棕榈酸为端基、二聚乙二醇单甲醚为侧链的谷氨酸二肽分子,并对其结构和性质进行了研究．由于该二肽分子中棕榈酸烃基具有疏水性、二聚乙二醇单甲醚的溶解行为具有温度响应性. 该新型两亲性二肽分子在水溶液中溶解性质,对于多肽药物的结构设计和负载释放等方面的研究具有一定的借鉴意义．

[1] Chen J, Wang H, Xu X, et al. Peptides and polypeptides for gene and drug delivery[J]. Acta Polymerica Sinica, 2011(8): 799-811.

[2] El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy[J]. J Control Release, 2004, 94(1): 1-14.

[3] Bae Y, Kataoka K. Intelligent polymeric micelles from functional poly(ethylene glycol)-poly(amino acid) block copolymers[J]. Adv Drug Del Rev, 2009, 61(10): 768-784.

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[5] Chen C, Wang Z, Li Z. Thermoresponsive polypeptides from pegylated poly-l-glutamates[J]. Biomacromolecules, 2011, 12(8): 2859-2863.

[6] Chen C, Wu D, Fu W, et al. Peptide hydrogels assembled from nonionic alkyl-polypeptide amphiphiles prepared by ring-opening polymerization[J]. Biomacromolecules, 2013, 14(8): 2494-2498.

[责任编辑：蒋海龙]

Synthesis and Characterization of a New Type of Amphiphilic Dipeptide

CHEN Ping, WANG Xiang, ZHI San-jun, WEI Chang-mei

(Jiangsu Key Laboratory for Chemistry of Low-dimensional Materials,School of Chemistry and Chemical Engineering, Huaiyin Normal University, Huaian Jiangsu 223300, China)

Herein, we describe the synthesis and characterization of a new type of amphiphilic dipeptide. The pegylated-L-glutamic acids were prepared by coupling between diethylene glycol monomethyl ether and L-glutamic acid. The N-terminal of the peptide was modified with palmitate via the reaction of amino and active ester. The obtained dipeptide displayed amphiphilic behaviors in water due to the different solubility of terminal alkyl chain and the side methylated ethyleneglycols.

peptide synthesis in liquid phase; amphiphilic dipeptide; glutamic acid

2016-10-09

国家自然科学基金资助项目(51403073)

陈平(1983-),男,讲师,博士,主要从事功能高分子材料的合成与性能研究． E-mail: chenping@iccas.ac.cn

O629.7

A

1671-6876(2017)01-0023-05