白芦藜醇对糖尿病小鼠肾脏内质网应激的影响

于中飞+刘鲁英

[摘要] 目的 探讨白芦藜醇对糖尿病小鼠肾脏组织内质网应激的影响。 方法 8周龄C57bl/6小鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病小鼠模型。将实验动物分为正常对照组、糖尿病未治疗组和糖尿病白芦藜醇治疗组。建模5个月后取肾脏组织行Western blot和RT-PCR检测内质网应激通路关键分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein， CHOP）与葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulated protein78，GRP78）表达水平。免疫组织化学染色观察肾脏组织CHOP的表达。结果 糖尿病白芦藜醇治疗组CHOP和GRP78表达水平相比糖尿病未治疗组明显减少（P<0.05），但两者均高于正常对照组（P<0.05）。 结论 白藜芦醇能明显降低糖尿病小鼠肾脏内质网应激水平。

[关键词] 糖尿病肾病 白芦藜醇 内质网应激

[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2016）12（b）-0072-03

糖尿病是一种严重危害人类健康的代谢性疾病，作为糖尿病最主要的慢性并发症之一[1]，糖尿病肾病已经成为糖尿病研究领域的重点。随着我国糖尿病发病率的上升，糖尿病肾病目前已成为仅次于各种肾小球肾炎的终末期肾脏病的第2位原因[1-2]。糖尿病肾病的发病机制主要包括糖代谢紊乱所致的炎症损伤，内质网应激，氧化应激以及血流动力学异常等[1-3]。由于其存在复杂的代谢紊乱，加之全身情况的异常，糖尿病肾病一旦发展到终末期，其治疗往往比其他肾脏疾病更加棘手，因此及时防治对于延缓糖尿病肾病的进展意义重大。在该研究中，通过对糖尿病小鼠进行药物干预，旨在探索白芦藜醇治疗对糖尿病肾病内质网应激的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

8周龄清洁级C57BL/6雄性小鼠（济南鹏悦动物有限公司）50只，分为3组：正常对照组（10只），糖尿病未治疗组（20只），糖尿病白芦藜醇治疗组（20只，于造模成功后1个月起每天给予白芦藜醇灌胃40 mg/kg）。

1.2 试剂与仪器

链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ），兔抗小鼠CHOP和GRP78抗体，兔抗小鼠GAPDH抗体、Cy3标记羊抗兔IgG， RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒。

1.3 糖尿病小鼠造模

造模前C57bl/6小鼠过夜禁食，次日开始连续5 d腹腔注射链脲菌素（STZ）50 mg/kg。注射完成后7 d，采用割尾法取血，快速血糖仪检测血糖，血糖值大于15.7 mmol/L为造模成功。每月进行监测血糖，不合格者淘汰出该实验。

1.4 基因检测

RT-PCR检测内质网应激关键因子CHOP和GRP78的基因表达水平各组小鼠过量麻醉处死后，迅速取新鲜肾脏膜组织。总RNA提取以及逆转录均按照提取试剂盒和逆转录试剂盒说明步骤进行操作。基因表达水平相对定量采用2-ΔΔCT法分析。

引物序列：CHOP： F5‘-AGGAGGTCCTGTCCTCAGATGA-3，R 5‘-ATGTGCGTGTGACCTCTGTTG-3；GRP78：F 5‘- CTCCGGCGTGAGGTAGAAAA -3，R 5‘- AGAGCGGAACAGGTCCATGT -3；GAPDH：F： 5- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG -3；R： 5- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG -3

1.5 Western Blot檢测内质网应激关键因子CHOP和GRP78的蛋白表达水平

取新鲜肾脏组织。提取蛋白，电泳后转膜。一抗（CHOP---1：500，GRP78---1：500，GAPDH---1：2 000），4℃孵育过夜。HRP标记二抗（1：5 000），室温孵育2 h。胶片显影照相。

1.6 免疫荧光检测

免疫组织化学染色观察内质网应激关键因子CHOP和GRP78的表达取各组小鼠肾脏组织行冰冻切片，厚度为10 μm。常规免疫荧光法检测。一抗为兔抗CHOP和GRP78抗体（1：100， 体积分数1%BSA+抗体，），二抗为Cy3标记羊抗兔IgG（1：100，体积分数1%BSA+抗体），细胞核染色为DAPI（1：5 000），封片后激光共聚焦荧光显微镜拍照。

1.7 统计方法

使用SPSS 15.0统计学软件进行统计学分析，各组数据均以平均值±平均差（x±s）表示，采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血糖和体重情况

3组小鼠取材前，血糖和体重检测数据见表1（各实验组小鼠已剔除血糖不合格者）。糖尿病组和白芦藜醇治疗组血糖水平明显高于正常组（P<0.05），而体重相比正常组明显减轻（P<0.05）。

2.2 各组小鼠肾脏组织CHOP和GRP78 mRNA相对表达量

糖尿病白芦藜醇治疗组小鼠肾脏组织中CHOP和GRP78的mRNA表达量明显低于糖尿病未治疗组，但两者都高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1。

2.3 各组小鼠肾脏组织CHOP和GRP78 蛋白表达量

糖尿病白芦藜醇治疗组小鼠肾脏组织中CHOP和GRP78的蛋白表达水平明显低于糖尿病未治疗组，但两者都高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图2。

2.4 各组小鼠肾脏组织CHOP和GRP78蛋白免疫荧光

糖尿病白芦藜醇治疗组小鼠肾脏组织中CHOP蛋白红色荧光染色强度较糖尿病未治疗组降低，但两者荧光强度均高于正常组，见图3。

3 討论

随着糖尿病发病率的升高，其相关并发症也越来越受到人们的重视。糖尿病肾病为其最主要的并发症之一，近年来一直是研究的热点。糖尿病肾病作为一种慢性进行性疾病，其发生发展机制的关键在于细胞内环境的稳态遭到破坏。内质网是一种广泛存在于细胞中的细胞器，对蛋白质的合成加工起到十分重要的作用。内质网本身正常功能的维持具有极强的内在体系，当遭到其他有害因素刺激时则会发生内质网应激反应（ERS，endoplasmic reticulum stress）。ERS在生理病理条件下的作用有明显差异，一定程度的ERS可能对细胞起保护作用，但是过度的ERS会加剧细胞损伤和细胞凋亡[4]。

机体在糖尿病状态下造成ERS可能的刺激因素包括高血糖，炎症反应，氧化应激，蛋白尿以及细胞内外电解质紊乱等。目前关于糖尿病肾病与内质网应激之间存在紧密关系的证据已经得到阐述[5-6]。有研究发现内质网应激与糖尿病发病的关键因素B细胞功能缺陷密切相关[7]。在体外实验中发现肾小管上皮细胞用高糖刺激后，ERS相关指示因子 （CHOP、GRP78、氧调节蛋白150等）的表达均出现明显升高；临床检测中也发现糖尿病肾病患者的肾组织中GRP78、氧调节蛋白150表达明显增加，提示ERS的发生和肾脏损伤的程度有关[8]。

白芦藜醇作为一种多酚化合物，具有抗氧化，清除自由基和抗内质网应激等多种药理活性作用，对人体多个器官起到保护作用[9-10]。但白藜芦醇对糖尿病肾病的保护机制中，扮演的阻断或减轻内质网应激尚无较深入的研究。该研究中，验证了白芦藜醇对糖尿病肾病的保护作用，检测了与其密切相关的内质网应激水平。结果显示，白芦藜醇可以明显降低糖尿病肾脏组织的内质网应激水平。当然，该研究仅初步探索了白芦藜醇降低内质网应激的药理作用，其关键机制还未阐明。后续，将对白芦藜醇的相关机制原理做进一步探索。

[参考文献]

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（收稿日期：2016-10-23）