红景天苷对大鼠急性心肌梗死后心室重构相关作用及机制的研究

马 杰，梁晓鹏，郭彩霞，陆培培，兰 玥，马丽红

红景天苷对大鼠急性心肌梗死后心室重构相关作用及机制的研究

马 杰，梁晓鹏，郭彩霞，陆培培，兰 玥，马丽红

目的 评价长期应用不同剂量红景天苷对于急性心肌梗死大鼠心室重构方面相关作用及机制。方法 建立结扎SD大鼠左前降支冠脉造急性心梗的模型，随机分为6组：红景天苷低、中、高剂量组(MI+SALL、MI+SALM、MI+SALH)，卡维地洛对照组(MI+CAVE)，模型组(MI)，假手术组(Sham)。灌胃给药干预56 d后超声评价监测心功能变化，计算左心室重量指数(LVW/BW)和全心重量指数(HW/BW)，测量左室射血分数(LVEF)、左室缩短率(LVFS)、左心室收缩期内径(LVIDS)。取梗死周边心肌组织，利用HE 染色，Masson 染色，天狼星红染色分别观察心肌组织病理生理学改变及心肌纤维化面积、非梗死区Ⅰ/Ⅲ型胶原比值。利用Western blot分析检测Wnt /β-catenin 信号通路关键的信号分子DVL-1和β-catenin蛋白的表达，整理数据统计分析。结果 与Sham组比较，MI组LVEF、LVFS值明显下降(P<0.01)，LVIDS上升、HW/BW值较高(P<0.05)，LVW/BW值则处于低水平(P<0.01)；灌胃后各组大鼠心肌梗死区域室壁总体变薄。HE染色结果显示，左室病理生理学改变显著；Masson染色结果显示，梗死周边区心肌胶原纤维明显增多，纤维瘢痕形成，心肌胶原面积较大；天狼星红染色结果显示有明显Ⅰ型、Ⅲ型胶原的沉积；梗死周边区Wnt /β-catenin Pathway中的关键性信号蛋白DVL-1和β-catenin呈现高表达水平(P<0.05)。与MI组比较，各治疗组可见有炎性细胞浸润，纤维组织增生，肌原纤维溶解；其中MI+SALM组LVEF和LVFS、LVW/BW值上升，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值下降(P<0.05)，MI+SALL组和MI+CAVE组心肌胶原面积、Ⅰ/Ⅲ型胶原比值明显下调(P<0.01)，LVEF和LVFS、LVW/BW值明显升高(P<0.01)，DVL-1和β-catenin的表达水平均明显下降(P<0.05或P<0.01)。两组之间无统计学意义(P>0.05)。MI+SALH组心肌胶原面积有一定程度减小(P<0.05)。各组体重变化及HW/BW值均无统计学意义(P>0.05)。结论 长期治疗干预下，应用小剂量的红景天苷优于中高剂量，能显著改善实验大鼠急性心梗后心室重构，抑制心肌纤维化。这一机制可能与其参与调控Wnt /β-catenin信号通路传导有关。

急性心肌梗死；心室重构；心肌纤维化；红景天苷；大鼠

急性心肌梗死(AMI)后的预后和转归是一系列心肌细胞肥大、坏死、凋亡、心室重构、纤维化的进程[1]。心肌缺血性损伤，进而引起心肌肥厚、室壁梗死反应性肥厚伸长和变形伴心功能降低。心肌间质的重构很大程度有成纤维细胞的增生，血管结构改变[2]。心肌纤维化发生细胞外基质过量沉积，各型胶原浓度和胶原容积显著增加。其中Wnt/β-catenin信号通路是较为关键的心肌纤维化信号通路之一[3]。近年来有实验研究发现[4]，红景天苷对肝纤维化大鼠模型的血管新生和细胞凋亡具有显著的改善作用，并且有诺迪康胶囊[5]和其粗提液对于心室重构影响的相关报道，但红景天苷单体对于阻止或逆转心室重构心肌纤维化的分子机制尚不清楚。故本实验采用大鼠AMI模型，探讨长期不同剂量红景天苷的干预对于急性心肌梗死大鼠心室重构方面相关作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选取SPF级120只体重(200±20)g雄性Sprague-Dawley大鼠，北京市维通利华实验动物技术有限公司提供。结扎左前降支冠脉造急性心梗模型。造模后及时行超声心动图检测，据左室射血分数(LVEF)判断造模是否成功(LVEF<60%)。将成功模型大鼠按随机数字表随机分为6组，分别为：红景天苷低、中、高剂量组(MI+SALL、MI+SALM、MI+SALH)，卡维地洛对照组(MI+CAVE)，模型组(MI)，假手术组(Sham)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性心梗模型的制作 以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。左胸部备皮后，仰卧位直视下行气管插管，呼吸机辅助呼吸并连接心电监测，消毒铺巾。剪开皮肤、皮下组织及肌肉，于第4肋间入胸，以左心耳下缘平齐位置为定位标记结扎左前降支，以心脏前壁局部颜色转为苍白为标准。结扎后可见心电图有ST-T改变，当左心室前壁部分颜色转为苍白且室壁运动减弱确认本模型制作成功。假手术组只穿线不结扎。大鼠AMI模型制作后使用超声心动筛选，模型入选标准为：①客观指标，LVEF<60%记录作为基线；②主观指标，超声科医师判断至少有一个层面的前壁室壁收缩运动明显异常。

1.2.2 实验药物用量 根据相关文献记录[6]和实验动物学中人临床常规剂量与大鼠换算系数6.3换算，红

景天苷(纯度99%，由中国食品药品检定研究院提供，产品编号GR0532)按低、中、高[12 mg/(kg·d)、24 mg/(kg·d)、36 mg/(kg·d)]三种干预剂量给予；卡维地洛按10 mg/(kg·d)给予；以上所需剂量均溶于生理盐水(10 mL/kg)后，于每日上午固定时间一次直接灌胃给药，假手术组、模型组给予等量生理盐水，造模成功24 h内后开始，持续56 d。

1.2.3 超声心动图检测血流动力学和心功能参数 称重并麻醉(方法同上)后，剔除胸部体毛，取仰卧位，采用M型多普勒超声选取标准左室乳头肌短轴切面和左室长轴切面监测心功能变化，每个原始数据取连续3个心动周期的平均值，采用单盲法操作，记录左室射血分数、左室缩短率(LVFS)、左心室收缩期内径(LVIDS)。取出大鼠心脏，放血完全，用预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取全心脏重量(HW)。完整剪下左室称重，得到左室重量(LVW)。分别计算左心室重量指数(LVW/BW)和全心重量指数(HW/BW)。

1.2.4 心脏标本的取材 大体观察心梗大鼠心脏标本后，去掉周围大血管及左右心耳，沿左室梗死部水平横切后，一部分常规病理HE 染色观察心肌组织病理生理学改变情况；Masson染色观察心肌间质纤维化并计算心肌胶原分数，即分析梗死周边区相同部位100×视野下胶原纤维所占面积的百分比；天狼星红染色计算非梗死区Ⅰ/Ⅲ胶原比值。另一部分心肌液氮固定，立即放入-80℃冰箱保存，Western blot检测Wnt /β-catenin 信号通路关键的信号分子蛋白DVL-1和β-catenin的表达。

2 结 果

2.1 一般情况 120只大鼠模型成功后存活83只，总存活率为69.2%。Sham组大鼠反应灵敏，行动敏捷，毛色有光泽；其余各组大鼠灌胃第1周活动减少，耸毛；部分大鼠极其虚弱，并发腹水死亡5只；1～2周后大鼠精神开始好转；第18天时症状基本消失，体重开始增加。中途由于各种原因死亡3只，干预56 d后，共计剩余75只：MI+SALL组13只，MI+SALM组12只，MI+SALH组13只，MI+CAVE组12只，Sham组14只，MI组11只。

取材时可见造模各组大鼠心脏均稍膨大，与胸腔粘连严重，梗死区域室壁总体呈黄白色，干燥无光泽，左室室壁常有塌陷，梗死与非梗死区域心肌相互掺杂。纵行切开心脏，可见梗死区域室壁不同程度变薄，坏死累及室壁各层。

2.2 心室重构血流动力学和心功能参数的变化 与Sham组比较，MI组LVEF、LVFS值明显下降(P<0.01)，LVIDS上升(P<0.05)；与MI组比较，MI+SALM组LVEF值和LVFS值上升(P<0.05)，MI+SALL组和MI+CAVE组LVEF和LVFS均明显升高(P<0.01)，与病理结果基本保持一致。各组LVIDS与MI组相比无明显差异(P>0.05)。详见图1。

注：A为治疗基线及终点前后各组室壁运动情况的超声心动图；B-D为各组治疗前后LVEF、LVFS、LVIDS的变化情况；E-F为各组全心重量指数(HW/BW)及左心室重量指数(LVW/BW)的比较；G为各组治疗前后体重的变化对比情况。与Sham组相比，*P<0.05；与MI组相比，#P<0.05；与MI组相比，**P<0.01。

治疗前(基线)后(第56天)各组体重变化均无显著差异。与Sham组比较，MI组HW/BW值较高(P<0.05)，LVW/BW值则处于低水平(P<0.01)；与MI组比较，各组HW/BW无显著差异，在LVW/BW值方面，MI+SALM组有升高(P<0.05)，MI+SALL组和MI+CAVE组则有明显升高(P<0.01)。

2.3 梗死周边区组织病理结构的改变 灌胃后各组大鼠心肌均出现病理改变。其中，HE染色结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠左室病理生理学改变显著，梗死边缘部分心肌细胞发生肥大、伸长、左心室壁部分心肌凝固性坏死，胞质伊红深染，另有部分发生疏松水肿心肌细胞肿胀、变性、溶解或坏死，肌原纤维扭曲，可见炎性细胞浸润，心肌纤维断裂，坏死病变广泛。各治疗组可见多数病灶吸收，个别仍有少量炎性细胞浸润，纤维组织增生，肌原纤维溶解。详见图2。

图2 HE染色(12.5×/200×)、Masson染色(400×)、天狼星红染色(100×) 下各组大鼠梗死周边区病理结构改变

Masson染色结果显示：较于Sham组，MI组心肌胶原纤维明显增多，纤维瘢痕形成，心肌胶原面积较大；与MI组比较，MI+SALH组有一定程度减轻(P<0.05)；MI+SALL组和MI+CAVE组最为明显(P<0.01)，但两组之间差异无显著统计学意义(P>0.05)。详见表1。

天狼星红染色结果显示：与Sham组对比，各组均有明显Ⅰ型、Ⅲ型胶原的沉积，MI组梗死周边区Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原均显著增加(P<0.05)；与MI组比较，MI+SALM组心肌胶原面积减小，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值下降(P<0.05)，而MI+SALL组和MI+SAVE组明显降低(P<0.01)，两组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.4 Wnt/β-catenin信号通路分子蛋白表达比较 通过Western blot对各组急性心梗后大鼠梗死周边区Wnt /β-catenin Pathway中的两个关键性信号分子DVL-1和β-catenin分析检测：与Sham组对比，MI组DVL-1和β-catenin呈现高表达水平(P<0.05)。与MI组比较，MI+SALL组、MI+SALM组和MI+CAVE组DVL-1和β-catenin的表达水平均明显下降(P<0.05)。其中，MI+SALL组最为明显(P<0.01)。详见图3。

组别n梗死周边区胶原面积(Masson100×)Ⅰ/Ⅲ胶原比值(SiriusRed100×)MI+SALL1336.20±10.903)0.83±0.033)MI+SALM1252.63±8.50 1.35±0.292)MI+SALH1327.96±4.672)1.23±0.50 MI+CA-VE1228.61±10.383)0.61±0.393)Sham148.42±9.700.85±0.25 MI1144.54±10.911)1.63±0.161) 与Sham组相比,1)P<0.05;与MI组相比,2)P<0.05,3)P<0.01。

注：与Sham组相比，*P<0.05；与MI组相比，#P<0.05；与MI组相比，**P<0.01。

图3 各组急性心梗后大鼠梗死周边区Wnt/β-catenin信号通路分子蛋白DVL-1和β-catenin的相对表达

3 讨 论

心肌纤维化的形成机制非常复杂，是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果[7]，如心衰时心肌细胞及心肌间质细胞的丢失、心肌成纤维细胞活化包括增殖及表型转变、心肌成纤维细胞合成和分泌的胶原蛋白成分改变引起的Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量的比值变化等因素，均促进了心肌胶原的大量沉积，再加上促胶原蛋白降解的基质金属蛋白酶的表达和活性下降，共同作用导致胶原的合成大大增加而降解大大降低，导致心肌纤维化的发生，是连续变化的过程[8]。心肌细胞外间质主要由胶原蛋白和纤维连接蛋白等形成一个互相连接的复杂的三维网络状空间结构，其主要成分是Ⅰ型、Ⅲ型胶原，二者表达增加且增加比率不协调是导致左心功能不全发生的原因之一[9]。各组大鼠心肌梗死区域室壁的改变反映心室重构的产生，包括梗死区室壁心肌变薄、拉长，产生膨出即梗死扩展和非梗死区室壁心肌的反应性肥厚、伸长，致左室进行性扩张和变形伴心功能降低等一系列过程[10]。

本研究发现梗死周边区心肌胶原纤维明显增多，纤维瘢痕形成，心肌胶原面积较大，有明显Ⅰ型、Ⅲ型胶原的沉积，其中Ⅰ型胶原起主要支架作用和维持正常运动，Ⅲ型胶原决定胶原纤维的直径大小和弹性[11- 12]。模型组胶原大量堆积但以Ⅰ型胶原占大多数，使得室壁弹性较差；而红景天苷干预后胶原纤维明显减少，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例降低，室壁具有一定的代偿运动能力。

中药单体、中成药及复方汤剂药对大鼠急性心梗后心室重构心肌纤维化均有一定的作用，甚或具有一定的优势[13]。红景天(Rhodiolarosea L.)为景天科红景天属，味甘苦，性平，归肺、心经，有益气活血通脉之功。现代药理证明其主要药理活性成分为红景天苷(Salidroside，Sal)和甙元酪醇，有增强免疫、促血管新生和抗凋亡等功效[14-15]。卡维地洛是FDA第一个批准为治疗心梗后心衰的第三代β受体阻滞剂。近年来的临床研究[16]表明，其不仅能降低心力衰竭病人的死亡率及改善预后，而且能防止甚至逆转缺血性心衰病人的左室重构。本研究发现红景天苷使得LVEF和LVFS、LVW/BW均显著增加，确实能改善实验大鼠急性心梗后心室重构，抑制心肌纤维化。作用与卡维地洛类似。可见在长期治疗干预下，应用小剂量的红景天苷作用优于中高剂量的红景天苷。

Wnt/β-catenin通路是心室重构的重要通路之一。蓬松蛋白(Disheveled-1，DVL-1)是Wnt信号通路的关键性信号分子之一，可激活经典的Wnt信号通路，显著性升高β-catenin的表达水平，进而刺激成纤维细胞分化，产生心肌纤维化[3]。本研究可以看出红景天苷低剂量组和卡维地洛组梗死周边区Wnt /β-catenin 信号通路中的关键性信号蛋白DVL-1和β-catenin均明显下降，抑制了经典的Wnt信号通路激活所诱导的心肌成纤维细胞的活化，减少心肌ECM蛋白的产生和蓄积，缓解病理性心肌纤维化和心室重构的进展[17]。

[1] Weisman HF，Bush DE，Mannisi JA，et al.Global cardiac remodeling after acute myocardial infarction： a study in the rat model[J].Journal of the American College of Cardiology，1985，5(6)： 1355-1362.

[2] Kehat I，Molkentin JD.Molecular pathways underlying cardiac remodeling during pathophysiological stimulation[J].Circulation，2010，122(25)： 2727-2735.

[3] Zelarayan LC，Noack C，Zafiriou MP，et al.Wnt signaling molecules in left ventricular remodeling： focus on dishevelled 1[J].Hypertension，2010，55(4)： 852-854.

[4] 吴晓玲.红景天甙对肝纤维化大鼠TGFβ-Smad信号通路的影响[D].重庆：重庆医科大学，2005.

[5] 李德剑，鲁波，莫书荣.诺迪康对急性心肌缺血和心衰大鼠血流动力学的影响[J].中国应用生理学杂志，2006，22(3)：291-292.

[6] Maekawa Y，Anzai T，Yoshikawa T，et al.Effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor inducer on left ventricular remodeling after acute myocardial infarction.[J].Journal of the American College of Cardiology，2004，44(7)：1510-1520.

[7] Abbate A，Bussani R，Sinagra G，et al.Right ventricular cardiomyocyte apoptosis in patients with acute myocardial infarction of the left ventricular wall[J].American Journal of Cardiology，2008，102(6)：658-662.

[8] Liu M，Wang XR，Wang C，et al.Panax quinquefolium saponin attenuates ventricular remodeling after acute myocardial infarction by inhibiting chopmediated apoptosis[J].Strock，2013，40(4)：339-344.

[9] Mckay RG，Pfeffer MA，Pasternak RC，et al.Left ventricular remodeling after myocardial infarction： a corollary to infarct expansion.[J].Circulation，1986，74(4)：693-702.

[10] Sun L，Cui M，Wang Z，et al.Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 improve remodeling in a rat model of acute myocardial infarction[J].Biochemical & Biophysical ResearchCommunications，2007，357(3)：779-784.

[11] Zhou Y，Jia ZM，Wang W，et al.Protective effect of spironolactone onventricular remodeling after acute myocardial infarction in rats[J].Journalof China Medical University，2006，35(5)：487-490.

[12] Ertl G，Gaudron P，Hu K.Ventricular remodeling after myocardialinfarction.Experimental and clinical studies[J].Archiv Fü rKreislaufforschung，1993，88(Suppl 1)：125-137.

[13] Liu J，Peter K，Shi D，et al.Traditional formula，modern application： Chinese Medicine Formula sini tang improves early ventricular remodeling and cardiac function after myocardial infarction in rats[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014： 1-10.

[14] Wang Y，Xu P，Wang Y，et al.The Protection of Salidroside of the heart against acute exhaustive injury and molecular mechanism in rat[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2013，2013： 1-8.

[15] 方国璋，王红星，尹华虎，等.心元胶囊抗心衰作用的实验研究[J].中国中医急症，2002，11(3)：208-209.

[16] Yaoita H.Different effects of carvedilol，metoprolol，and propranolol on left ventricular remodeling after coronary stenosis or after permanent coronary occlusion in rats[J].Circulation，2002，105(8)： 975-980.

[17] Hua JY，He YZ，Xu Y，et al.Emodin prevents intima thickness via Wnt4/Dvl-1/β-catenin signaling pathway mediated by miR-126 in balloon-injured carotid artery rats[J].Experimental & Molecular Medicine，2015，47(6)： e170.

(本文编辑王雅洁)

Effect and Mechanism of Salidroside on Ventricular Remodeling after Acute Myocardial Infarction in Rats

Ma Jie， Liang Xiaopeng， Guo Caixia， Lu Peipei， Lan Yue，Ma Lihong

State Key Laboratory of Cardiovascular Disease，Fuwai Hospital，National Center for Cardiovascular Diseases，Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Beijing 100037， China

Ma Lihong

Objective To investigate the effect and mechanism of salidroside on ventricular remodeling after acute myocardial infarction (AMI) in rats.Methods The AMI rat model was established by ligating the left anterior descending coronary artery.The Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into 7 groups: sham operation group， model group， carvedilol control group， low-， middle-and high-dose salidroside group.After 56 days of administration，the left ventricular mass index (LVW/BW) and total heart weight index (HW/BW) were calculated and the left ventricular ejection fraction (LVEF) and left ventricular shortening rate (LVW) were measured.The left ventricular fractional shortening (LVFS) and left ventricular systolic diameter (LVIDS) in the infarcted myocardium were measured by HE staining， Masson staining and Sirius red staining.The ratio of type Ⅰ/Ⅲ collagen in the non-infarcted area was measured by the histopathological changes and myocardial fibrotic area The expressions of disheveled-1 (DVL-1)， β-catenin， a key signal of Wnt/β-catenin signaling pathway， were detected by Western blot analysis.The data was analyzed statistically.Results Compared with sham operation group， the myocardial pathological changes were significantly higher in model group (P<0.05).The myocardial collagen fibers in the infarcted area were significantly increased in model group (P<0.01).LVIDs increased and HW/BW was higher in model group (P<0.01)， and the collagenous area of cardiac muscle was larger in model group (P<0.01).The results of Sirius red staining showed that collagen Ⅰ， Ⅲ collagen deposition， LVEF and LVFS were significantly decreased in model group (P<0.01).The expression of DVL-1 and β-catenin in infarcted area was significantly higher in model group (P<0.05).Compared with model group， inflammatory cell infiltration， fibrous tissue hyperplasia and myofibrillysis were found in each treatment group.LVEF and LVFS and LVW/BW increased， and collagen type Ⅰ/Ⅲ decreased in middle-dose salidroside group (P<0.05).LVL/LVW/BW were significantly increased (P<0.01)， the ratio of DVL-1 and DVL-1 were significantly decreased，β-catenin expression was significantly decreased in low-dose salidroside group and carvedilol control group (P<0.01 or P<0.05).There was no statistically significant difference between two groups (P>0.05).The area of myocardial collagen in high-dose salidroside group decreased to a certain extent (P<0.05).There was no significant difference in body weight and HW/BW between the two groups (P>0.05).Conclusion The low-dose salidroside can significantly improve the ventricular remodeling and myocardial fibrosis in rats after AMI， which was better than that of high-dose salidroside in the long-term treatment intervention.This mechanism may be involved in the regulation of Wnt / β-catenin signaling pathway.

acute myocardial infarction;ventricular remodeling;myocardial fibrosis;salidroside;rats

北京中医药薪火传承3+3工程专项

中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，心血管疾病国家重点实验室(北京100037)

马丽红，E-mail：mlh4463@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.010

1672-1349(2017)06-0671-006

2017-01-19)

引用信息：马杰，梁晓鹏，郭彩霞，等.红景天苷对大鼠急性心肌梗死后心室重构相关作用及机制的研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(6)：671-676.