红景天及红景天苷对低氧状态下脐静脉内皮细胞增殖及表达的影响Δ

姜晓斐，罗心平，施海明

(复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040)

·论 著·

红景天及红景天苷对低氧状态下脐静脉内皮细胞增殖及表达的影响Δ

姜晓斐*，罗心平，施海明#

(复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040)

目的：探讨红景天及红景天苷对低氧状态下脐静脉内皮细胞增殖及表达的影响。方法：培养人脐静脉内皮细胞，并将其分为正常氧对照组、低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组。采用CCK8法比较不同干预时间和质量浓度下的细胞增殖情况，采用SYBR Green实时定量聚合酶链式反应法检测mRNA的表达水平，采用Western Blot法检测蛋白表达水平。结果：低氧状态下，红景天和红景天苷均可促进细胞增殖。当红景天培养液质量浓度为10 μg/ml、干预时间为24 h时，红景天对细胞的促增殖作用最显著。低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组细胞的肾上腺髓质素和降钙素受体样受体的mRNA、蛋白表达明显高于正常氧对照组，且低氧红景天组、低氧红景天苷组明显高于低氧对照组，低氧红景天组明显高于低氧红景天苷组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：红景天可促进细胞增殖，促进肾上腺髓质素和降钙素受体样受体的mRNA、蛋白表达，而红景天苷是红景天该作用的重要但非唯一有效成分。

红景天； 红景天苷； 细胞增殖； 肾上腺髓质素； 降钙素受体样受体

红景天为景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物[1]，根茎用药，具有耐缺氧、抗心肌缺血、抗衰老、调节免疫及促低氧状态下细胞增殖的作用[2-3]。红景天中含有苷、苷元、香豆素等物质，而红景天苷是目前评价红景天药材质量的主要指标[4-6]。但红景天苷是否能够完全替代红景天的促细胞增殖作用尚需进一步探讨。肾上腺髓质素(ADM)属于降钙素基因相关肽家族成员，通过与降钙素受体样受体(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)结合可发挥包括促血管新生在内的多种生理效应[7-8]。ADM及CRLR基因启动子中都含有低氧诱导因子(HIF-1)结合位点，红景天的促细胞增殖作用与HIF-1相关[9]，而该作用与ADM途径是否相关及红景天苷在其中是否发挥主要作用尚需研究。本研究比较了红景天水提剂与红景天苷单体对细胞增殖及ADM、CRLR的调节作用。

1 材料与方法

1.1 培养液的制备

1.1.1 对照培养液：含10%胎牛血清的1640培养液。

1.1.2 红景天培养液：大花红景天生药/块茎(上海雷允上大药房)粉碎成粉状后加蒸馏水浸泡2 h，置于中药提取罐，加热至100 ℃、煎煮2 h，无菌纱布滤出药汁后再重复2次，混合3次提取液，200目筛网过滤，得澄清药液，真空浓缩至约4 L后置于真空干燥箱干燥72 h，再置于-80 ℃冰箱过夜后使用粉碎机粉碎成干粉，于-80 ℃冰箱保存待用，每1 kg 红景天生药制成红景天干粉211.59 g。红景天干粉采用去离子水溶解，高效液相色谱-紫外检测法测定干粉中红景天苷含量为0.83%，即每1 g红景天干粉中含有8.3 mg红景天苷。将红景天干粉用去离子水溶解后无菌过滤，制成100 μg/ml的母液，实验前用含10%胎牛血清的1640培养液稀释，即得。

1.1.3 红景天苷培养液：取红景天苷粉(纯度99%，上海康九化工有限公司)用去离子水溶解后无菌过滤，制成0.83 μg/ml的母液，实验前用含10%胎牛血清的1640培养液稀释，即得。

1.2 人脐静脉内皮细胞培养

取传代4～6次、处于对数生长期的细胞用0.25%的胰酶消化，调整细胞悬液的细胞密度，以4×104/ml的细胞密度接种于75 cm2细胞培养瓶，每瓶15 ml细胞悬液，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱，24 h后更换培养液进行相关研究。

1.3 分组与处理

将人脐静脉内皮细胞分为正常氧对照组、低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组。其中正常氧对照组更换对照培养液，继续在37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养24 h；低氧对照组更换对照培养液，置于低氧培养箱内低氧处理24～72 h；低氧红景天组更换红景天培养液，置于低氧培养箱内低氧处理24～72 h；低氧红景天苷组更换红景天苷培养液，置于低氧培养箱内低氧处理24～72 h。本研究采用的低氧状态为1%O2、5%CO2、94%N2，所有细胞实验均至少重复3次或3个复孔。

1.4 观察指标

1.4.1 CCK8法：比较红景天与红景天苷在不同干预时间和质量浓度下细胞增殖情况。选取6个红景天干预质量浓度及对应的红景天苷干预质量浓度(见结果)，不同质量浓度药物干预24、48、72 h后测定各孔吸光度OD值，无细胞仅含检测液孔为空白对照孔，根据OD值计算细胞增殖率。相对细胞增殖率(%)=(药物实验组OD值-空白组OD值)/(低氧对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4.2 SYBR Green法：实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测mRNA表达水平。利用美国国立生物技术信息中心基因序列数据库，查得ADM(GeneID：133)、CRLR(GeneID：10203)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(GeneID：2597)的基因序列，见表1。使用ABI PRIMER EXPRESS 2.0软件设计PCR引物(由上海基星生物技术公司设计，上海生工生物工程有限公司合成)；Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA(FSQ-101，TOYOBO公司)，三步法进行Realtime PCR扩增(QPK-212，TOYOBO公司)，循环条件为：95 ℃、60 s，1个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、45 s，40个循环。

表1 SYBR Green实时定量PCR引物序列Tab 1 Sequences of PCR primers at real-time quantification SYBR Green

1.4.3 Western Blot法：检测蛋白表达水平。冷聚丁二酸丁二醇酯清洗贴壁细胞2次，加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂，每106个细胞中加入抽提试剂1 ml，冰浴下摇动15 min进行充分裂解，预冷的离心机12 000 g离心15 min，收集上清液，二喹啉甲酸法进行蛋白质定量，蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏氟乙烯膜上，5%牛血清白蛋白溶液中室温(25 ℃)封闭膜1 h，TBS/T洗膜3次，加入ADM(R&D SYSTEMS公司)、CRLR(R&D SYSTEMS公司)、β-actin(R&D SYSTEMS公司)4 ℃过夜，TBS/T洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二级抗体室温孵育1 h，TBS/T洗膜3次，3,3-四盐酸二氨基联苯胺显色液显色，X光胶片曝光显影，Image J分析软件对灰度值进行量化分析。

1.4.4 RQ的计算公式为：用ΔΔCT相对定量方法表示治疗组样本基因表达的数量，ΔΔCT=(治疗组样本基因均值CT-治疗组管家基因均值CT)-(对照组样本基因均值CT-对照组管家基因均值CT)，治疗组样本基因相对于对照组样本基因的量(RQ值)通过公式2-(ΔΔCT)计算得到。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 药物质量浓度和干预时间对细胞增殖的影响

红景天和红景天苷的促细胞增殖作用趋势基本一致，但红景天更明显。当红景天培养液质量浓度>50 μg/ml(或相当于该质量浓度的红景天苷培养液)，其对细胞增殖的促进作用基本消失，甚至抑制细胞增殖；红景天培养液浓度为10 μg/ml干预24 h时促细胞增殖作用最显著，是低氧对照组细胞增殖率的1.9倍，故选定该条件为下一步实验的干预条件见表2、图1。

2.2 四组细胞ADM、CRLR的mRNA表达相对量

低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组细胞的ADM和CRLR的mRNA表达明显高于正常氧对照组，且低氧红景天组、低氧红景天苷组明显高于低氧对照组，低氧红景天组明显高于低氧红景天苷组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.3 四组细胞ADM和CRLR的蛋白表达情况比较

低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组细胞的ADM和CRLR的蛋白表达明显高于正常氧对照组，且低氧红景天组、低氧红景天苷组明显高于低氧对照组，低氧红景天组明显高于低氧红景天苷组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2—3。

表2 药物质量浓度和干预时间对细胞增殖的影响Tab 2 Effect of different times of intervention and different concentration on cell proliferation

图1 药物质量浓度和干预时间对细胞增殖的影响Fig 1 Effect of different intervention time and concentration on cell proliferation

组别ADMmRNACRLRmRNA正常氧对照组1.000±0.3201.000±0.249低氧对照组2.322±0.7401.481±0.326低氧红景天组11.917±1.1453.451±0.202低氧红景天苷组6.928±1.0282.573±0.297

图2 四组细胞ADM和CRLR的蛋白表达情况Fig 2 Protein expression of ADM and CRLR of four groups

图3 四组细胞ADM和CRLR蛋白表达情况柱形图Fig 3 Column diagram of protein expression of ADM and CRLR of four groups

3 讨论

目前，红景天苷是红景天公认的主要有效成分[4]，许多相关研究采用红景天苷作为对照品。为保证红景天与红景天苷比较时成分含量一致，本研究根据以往同类研究经验，将红景天药物制成易于保存的干粉，并采用高效液相色谱-紫外检测器定量测定干粉中的红景天苷单体含量，既保证了比较的合理性，同时也解决了红景天药物的质控和定量问题。

ADM最初是从人嗜铬细胞瘤中发现的一种强降压肽，CRLR是一种跨膜蛋白，属于鸟嘌呤三磷酸结合蛋白偶联受体家族成员(B型或Ⅱ型)，通过激活型G蛋白和腺苷酸环化酶产生环磷酸腺苷，ADM通过与CRLR结合产生作用，ADM和它的受体在多个器官组织中都有表达，ADM mRNA在心血管系统有相当高的水平，有充足的证据显示ADM有明确的促血管生长和心血管系统保护作用[10-12]。以往的研究结果证实，红景天在大鼠心肌梗死模型中的促血管新生作用与红景天靶向作用于心肌局部ADM及受体相关[12-14]。

本研究结果显示，红景天及红景天苷均在低氧情况下具有促细胞增殖作用，该作用与ADM途径相关。同时，过高质量浓度的红景天及红景天苷反而会抑制细胞增殖，可能与过高质量浓度药物对细胞的毒性有关，这与以往研究的结果类似。提示红景天苷是红景天促增殖作用的主要成分之一，但非唯一有效成分。低氧对照组、低氧红景天组、低氧红景天苷组细胞的ADM和CRLR的mRNA、蛋白表达明显高于正常氧对照组，且低氧红景天组、低氧红景天苷组明显高于低氧对照组，低氧红景天组明显高于低氧红景天苷组，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明红景天及红景天苷对ADM及其受体CRLR在mRNA及蛋白表达上均有促进作用，且该作用具有同步同向性。ADM途径是红景天及红景天苷低氧状态下促细胞增殖作用的机制之一，而该作用的机制可能与HIF-1等ADM与CRLR的共同上游因子的影响相关[15]。

综上所述，红景天可促进细胞增殖，促进ADM和CRLR的mRNA、蛋白表达，而红景天苷是红景天该作用的重要但非唯一有效成分。

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Effects of Rhodiola Rosea and Salidroside on the Proliferation and Expression of Human Umbilical Vein Endothelial Cells under Hypoxia ConditionΔ

JIANG Xiaofei,LUO Xinping,SHI Haiming

(Dept. of Cardiology,Huashan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,China)

OBJECTIVE: To probe into the effects of rhodiola rosea and salidroside on the proliferation and expression of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under hypoxia condition. METHODS: HUVECs were cultivated and divided into normoxia control group,hypoxia control group,hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group. CCK8 assay was adopted to compare the cell proliferation at different times of intervention and different concentrations,SYBR Green fluorescent quantitative polymerase chain reaction assay was adopted to detect the expression of mRNA at real-time,and the Western Blot assay for the expression of protein. RESULTS: Under hypoxia condition,both rhodiola rosea and salidroside can improve the cell proliferation. The improvement of rhodiola rosea was the most significant at the concentration of 10 μg/ml and the intervention of 24 h of the nutrient solution. The mRNA and protein expression of adrenomedullin and calcitonin receptor like receptor of hypoxia control group,hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group were significantly higher than that of the normoxia control group,and that of the hypoxia rhodiola rosea group and hypoxia salidroside group were significantly higher than the hypoxia control group,that of the hypoxia rhodiola rosea group was significantly higher than the hypoxia salidroside group,with statistically significant differences (P<0.05). CONCLUSIONS: The rhodiola rosea can improve cell proliferation,promote the mRNA and protein expression of adrenomedullin and calcitonin receptor like receptor,the salidroside is an important but not the only effective constituent of rhodiola rosea of thees functions.

Rhodiola rosea; Salidroside; Cell proliferation; Adrenomedullin; Calcitonin receptor like receptor

国家自然科学基金资助项目(No.81573710)

R932

A

1672-2124(2017)08-1022-04

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.08.006

2017-07-04)

*主治医师。研究方向：中西医结合治疗缺血性心脏病、心力衰竭。E-mail：sule_jiang@126.com

#通信作者：教授。研究方向：心血管内科。E-mail：shihm@medmail.com.cn