脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌变化的实验研究

李毓新

脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌变化的实验研究

李毓新

目的 探讨脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌变化情况，以期为临床上治疗提供有效依据。方法 选取30只大鼠为研究对象，每组10只，分别为对照组、 手术组和脊髓损伤组。对照组为正常大鼠，手术组行椎板切除术，脊髓损伤组行胸10完全脊髓损伤。在制成模型后1周、2周、4周、12周、24周观察大鼠坐骨神经-运动终板-内侧腓肠肌形态变化情况。结果 脊髓损伤电镜下坐骨神经术后12周有髓神经纤维髓鞘崩解，崩解髓鞘板层清晰，术后24周有髓神经纤维髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和无髓神经纤维12周后增多；腓肠肌光镜下术后12周局部肌细胞边界清楚，多数模糊，肌细胞核相对聚集，结缔组织增生明显；术后24周肌细胞融合，细胞核密集，融合细胞间见有空隙，结缔组织增生明显；电镜下运动终板术后12周突触皱褶和突触前后膜不可辨，突触结构紊乱，肌纤维明暗带清晰，z线不连续，高倍镜下突触皱褶未见，突触前后膜不可辨，可见类圆形突触小泡和细小颗粒，肌板结构清晰。结论 大鼠脊髓损伤后在损伤平面以下周围神经、运动终板、骨骼肌在形态上会发生规律性变化，12周后显著变化，24周后则毁损性改变。

脊髓损伤；远端神经元；骨骼肌变化；大鼠

脊髓损伤是临床上治疗较为棘手疾病，治疗目的是恢复损伤平面以下运动和排泄功能。但这依赖于脊髓传导性、脑和周围神经肌肉保持良好功能，三者只有统一协调才能恢复满意。若远端神经或肌肉不可逆损伤则脊髓传导恢复几乎不可能。有研究称，切断胸12脊髓制造完全性截瘫动物模型，在伤后3周、6周切除下肢全部神经干，病理检查发现神经纤维、髓鞘等无明显变化[1]。也有研究认为，在大鼠胸10完全脊髓横断损伤后，光镜和电镜观察腓总神经形态学变化，发现脊髓损伤后腓总神经髓鞘和轴索会出现明显退变，且退变随时间推移而逐渐加重，会出现轴索发芽现象[2]。故大鼠完全横断脊髓损伤后会造成损伤平面以下周围神经发生跨神经元变性。本研究观察脊髓损伤后损伤平面以下神经、肌肉、运动终板在自然病程中形态学变化，为脊髓损伤临床诊治提供有效时间窗。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选取30只大鼠，分为对照组、手术组和脊髓损伤组，每组10只。近交系，均为雄性，体重(200±10)g，由北京试验动物中心提供。

1.2 动物模型制备 大鼠术前禁食12 h，称体重后采取10%水合氯醛(3～4)mL/kg腹腔内注射麻醉，俯卧在手术台上，备皮消毒后以胸10棘突为中心行背侧正中切口，长约3 cm，紧贴棘突骨面纵向分离椎旁肌肉和软组织，显露出胸9～11椎板和棘突，咬除胸9～11棘突和移除胸10椎板，显露胸10水平脊髓，并用剪刀迅速横断胸10脊髓，在脊髓断端头侧切除2 mm脊髓组织，移除后在脊髓端置入明胶海绵。逐层缝合，在试验期间人工排尿2～3次每日，直至恢复正常排尿为止。手术组则仅行棘突和椎板切除，不损伤脊髓。

1.3 取材 以体积分数10%水合氯醛麻醉后从左心室插管后剪开右心耳，灌注生理盐水冲洗待液体清亮后用40 g/L多聚圈经心脏缓慢灌注，结束后取右侧坐骨神经1 cm，腓肠肌肌腹中部神经入肌处取0.8 cm肌肉和小腿内侧腓肠肌肌腹1 cm，固定12 h后进行处理，石蜡打包后将内侧腓肠肌标本进行连续横向切片，厚度为10 μm，进行苏木精-伊红染色，将坐骨神经和运动终板行半薄切片后在光镜下进行定位，超薄切片后行电子染色进行透视电镜观察。观察电镜下坐骨神经和内侧腓肠肌运动终板情况，光镜下观察内侧腓肠肌情况。

2 结 果

2.1 电镜下脊髓损伤观察结果 对照组有髓神经纤维、无髓神经纤维一直存在，髓鞘外形正常。手术组有髓神经纤维外形正常。脊髓损伤则出现规律性变化，表现为术后2周有髓神经纤维髓鞘正常，术后4周有髓神经纤维崩解、板层分离，有髓神经纤维和无髓神经纤维。术后12周有髓神经纤维崩解增多、碎裂、崩解髓鞘板层清晰，新生神经纤维髓鞘细壁薄，无髓神经纤维增多，术后12周有髓神经纤维髓鞘崩解，崩解髓鞘板层清晰，术后24周有髓神经纤维髓鞘已模糊、碎裂髓鞘增多，薄髓和无髓神经纤维12周后增多。 详见图1。

注：A和B为术后2周表现，C和D为脊髓损伤术后4周表现，E和F为脊髓损伤后12周变化；G和H为脊髓损伤24周所见。

图1 电镜下脊髓损伤观察结果

2.2 腓肠肌光镜下观察结果 对照组细胞肌束膜和肌内膜边界清楚，肌细胞核位于肌膜下方。手术组术后2周肌细胞肌束和肌内膜边界清楚，脊髓损伤术后2周肌细胞结细胞略缩小，术后4周肌细胞截面积缩小，局部肌细胞破坏明显，术后12周局部肌细胞边界清楚，多数模糊，肌细胞核相对聚集，结缔组织增生明显；术后24周肌细胞融合，细胞核密集，融合细胞间见有空隙，结缔组织增生明显。详见图2。

注：A为对照组肌细胞，B为手术组术后2周肌细胞，C，D，E，F为脊髓损伤术后2周、4周、12周、24周肌细胞截面积和组织变化，脊髓损伤术后24周肌细胞融合，细胞核密集，融合细胞间间隙不一，结缔组织增生明显。

图2 腓肠肌光镜下观察结果

2.3 电镜下运动终板观察结果 脊髓损伤术后4周突触皱褶结构清晰，突触内可见细颗粒状物质，高倍镜下观察可见突触前后膜清晰，突触间隙、皱褶清晰，各个结构内见细小颗粒，术后12周突触皱褶和前后膜清晰，突触内可见细小颗粒，肌纤维明暗可见，z线不连续。高倍镜下突触皱褶清晰，突触前后膜层次分明，结构内可见细小颗粒，肌板清晰；术后12周突触皱褶和突触前后膜不可辨，突触结构紊乱，肌纤维明暗带清晰，z线不连续，高倍镜下突触皱褶未见，突触前后膜不可辨，可见类圆形突触小泡和细小颗粒，肌板结构清晰。详见图3。

注：A为术后4周横截面(1万倍)，B为术后4周横截面(4万倍)，C为术后12周纵切面(4万倍)，D为术后12周纵切面(4万倍)，E为术后12周纵切面(5千倍)，F为术后12周纵切面(4万倍)，术后12周突触皱褶和突触前后可辨，可见细小颗粒，肌纤维明、暗带清晰，z线不连续，同时突触皱褶隐约可见突触内颗粒，突触前结构紊乱，肌纤维清晰，z线不连续。

图3 电镜下运动终板观察结果

3 讨 论

大鼠脊髓横断性损伤4周后坐骨神经出现有髓神经纤维髓鞘退变，且会随着时间推移而变化，12周后髓鞘出现崩解碎解现象，伴随有新生薄髓和大量无髓神经纤维，24周后最明显，髓鞘破裂最明显，髓鞘结构层模糊不清。这和手术、正常大鼠比较有明显不同，这可推测出脊髓损伤后远端神经元发出轴突构成周围神经发生退变，且会随着时间进行性加重。结合相关报道[3]，是因为存在跨神经元变性。脊髓损伤后发生跨神经元变性时间窗为20周左右。另外，动物模型不同如挫伤模型、压迫模型、缺血损伤模型、横断模型，同一实验动物不同脊髓损伤模型对损伤结构和运动功能影响不同[4-5]。

在运动终板形态上，脊髓横断性损伤4周后内侧腓肠肌运动终板结构完整，突触皱褶清晰，12周退变和完整运动终板均存在，但24周后则无法找到运动终板，这说明完全性脊髓损伤病程中，随着观察时间延长，运动终板结构会出现不可逆退变性变化；这和有些报道结果类似[6-7]，脊髓横断损伤后运动终板着色，数量上和正常无明显变化，脊髓损伤4周后肌纤维运动终板出现退变，终板染色变浅，轴索终末减少，终板核减少，肌浆淡染，终板边缘皱缩，中央出现空泡样淡然区。脊髓损伤8周后运动终板会出现明显退变，染色区空白。免疫组织化学技术证实横断性脊髓损伤大鼠后肢神经肌肉接头发生解剖学不稳，突触前后结构减少和轴突终末芽生，神经肌肉突触出现选择性分解[8-9]。

在腓肠肌形态变化上，结果显示，脊髓损伤4周后腓肠肌肌细胞截面积缩小，且截面积和观察时间呈负相关。12周肌细胞萎缩明显，大量结缔组织增生，24周后肌细胞大片融合，无法确认肌细胞结构，且结缔组织增生明显，而手术组和正常组则无此变化。推测脊髓损伤后肌细胞会发生进行性蜕变，肌细胞截面积缩小，后期表现为一些肌纤维形态结构破坏和结缔组织填充[10-11]。这和报道结果类似[12-13]，脊髓损伤后大鼠肌纤维数目减少[14]，肌纤维萎缩，表现为肌肉截面积缩小，肌肉质量下降，肌间脂肪堆积。 大鼠比目鱼肌和内侧腓肠肌在脊髓损伤后1周下降22%和27%[15]。脊髓损伤后3周下降15%和18%，脊髓损伤10周和脊髓损伤3周在肌肉湿重量上相近。

大鼠在完全性横断性脊髓损伤自然病程中损伤平面以下周围神经、运动终板和骨骼肌在形态上会发生规律性变化，12周会发生显著改变，24周后则出现不可逆损伤。

本研究中存在缺陷有，未将神经电生理学相关评价标准纳入，这样就不能从量化程度上反应神经肌肉运动功能变化情况。但大鼠脊髓损伤和人脊髓损伤在运动神经元和骨骼肌上有一定相近性，对治疗时间窗有一定的作用。

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(本文编辑王雅洁)

西安医学院第二附属医院(西安 710000)，E-mail：liyuxinyxtg@163.com

引用信息：李毓新.脊髓损伤大鼠远端神经元及骨骼肌变化的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(6)：686-688.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.013

1672-1349(2017)06-0686-04

2016-08-30)