葛根素对HIE新生大鼠神经及PI3KAkt信号通路的作用机制研究

范少平，丁文学，梁碧先

葛根素对HIE新生大鼠神经及PI3KAkt信号通路的作用机制研究

范少平，丁文学，梁碧先

目的 观察葛根素对缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)新生大鼠的神经保护作用，分析神经保护作用是否涉及PI3K/Akt 信号通路的参与以及可能的机制。方法 90只新生7 日龄Wistar 大鼠随机分为假手术组(n=10)、HIE 组(n=40)及葛根素疗组(n=40)，后两组又进一步分为3 h、6 h、12 h、24 h 4 个时间点，每个时间点10 只。参照Rice 等和吴婉芳法，建立新生大鼠HIE 模型。HE 染色观察各组大鼠神经元形态变化，免疫组织化学法检测磷酸化Akt 的表达。依据免疫组化的结果采用Western blot 方法进一步检测PI3K/Akt 信号通路表达。结果 90只Wistar大鼠模型全部成功，全部纳入结果分析。HE 染色示葛根素治疗组大鼠大脑皮层和海马区神经细胞坏死率较HIE 组明显减少。免疫组化结果示：随着时间的延长，葛根素治疗组磷酸化Akt 蛋白阳性率较HIE 组显著上调(P<0.01)。HIE 组磷酸化Akt 在12 h 时达到高峰，但葛根素治疗组在24 h 时达到高峰；在每组每个时间点葛根素组磷酸化Akt 蛋白的阳性表达均高于HIE 组(P<0.01)。假手术组亦有极少量表达。Western blot 结果示：在各个时间点内，各组总Akt 的表达一致；但磷酸化Akt 的表达(Ser473 和Thr308)在葛根素治疗组明显强于HIE 组；且随着时间变化，其表达于上述免疫组化的检测大致一致。葛根素显著提高磷酸化Akt 的水平，既可作用于Ser473 磷酸化位点，也可作用于Thr308 磷酸化位点。结论 葛根素对HIE大鼠具有神经保护作用。葛根素可激活PI3K/Akt通路来发挥其对HIE新生大鼠神经元的保护作用，其机制可能与上调磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表达水平，增加Akt磷酸化水平的表达有关。

缺氧缺血性脑病；葛根素；神经保护；新生大鼠

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生儿常见疾病，有着较高的致死率和致残率，HIE对新生儿生命有着严重的威胁，该病症还会引起新生儿脑瘫，癫痫，智力低下，精神运动发育迟缓停止等严重神经系统后遗症的疾病。这几年来，新生儿缺血性脑病的发病率越来越高，已经超过了产伤性颅内出血，所以新生儿脑损伤最常见的原因就是缺血性脑病。传统中药葛根在我国使用已有几千年历史，葛根素是从葛根中分离得到的4，7-二羟基一级8-β-D 葡萄糖异黄酮，它们都是多羟基的黄酮类化合物，分子量比较小，主要在治疗心血管疾病方面有较好的效果，其本身活性强、药理作用强、药代动力学良好、没有毒副作用。葛根素能够对缺血性脑损伤产生保护作用，但是其相关的保护机制还需要进一步的研究分析，接下来主要是研究葛根素怎样在不同脑缺血中影响脑神经细胞的缺血缺氧，还对脑缺血再灌注损伤之后敏感蛋白如何表达有一定的影响。本研究主要是把出生一周的新生大鼠制作成HIE模型，在腹腔注射葛根素，密切观察葛根素是否能够治疗新生大鼠的HIE，葛根素的影响位点及作用途径是否涉及PI3K/Akt 信号通路，这也是本次实验试图证实之处。以期为葛根素在临床上治疗新生儿HIE 提供可行性实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 动物：SPF级7日龄(以出生日计算为0天)，Wistar大鼠购自我院实验动物研究中心，雌雄不限，营养中等，体重19 g～21 g，共90只。在模型制备后及观察阶段放回饲养笼，在自然状态下由母鼠哺乳喂养，保持适宜的光照，室温和空气湿度等。

主要试剂：葛根素购自山东省烟台鲁银药业有限公司。磷酸化Akt 一抗，免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德公司(用于免疫组化)。磷酸化Akt 信号通路试剂盒购自美国NeoMarkers 公司(用于western blot 检测总Akt、磷酸化AktSer473、磷酸化AktThr308)。鼠抗β-actin单克隆抗体购自sigama公司。硝酸纤维素膜购自Sigama公司。Tris Base、溴酚蓝、NP40、Tris-Hcl、脱氧胆酸钠、SDS、甘氨酸、过磷酸胺、DTT、四甲基乙二胺、TWEEN20购自Sigama公司。甲醇为国产分析纯。脱脂奶粉市售。氧气由我院提供，氮气购自武汉造船厂，自行配制8%氧气和92%氮气混合气体。其他：乙醚、5%水合氯醛、4%多聚甲醛、眼科剪、组织剪、纱布、丝线、显微镜等均由我院实验动物中心实验室提供。

仪器和设备：便携式数字测氧仪：上海第三分析仪器厂。自制常压缺氧舱：直径为40 cm，高60 cm 的圆柱形透明塑料容器，上下各有1个直径1 cm的小孔与外界相通。UV-754 紫外分光光度计：让奇(上海)仪器科技有限公司。HQ45 恒温摇床：金坛市顺华仪器有限公司。垂直电泳槽：上海佑伟实业有限公司。电转仪：宁波新芝生物科技股份有限公司。Bio-Rad GELDOC-2000 紫外凝胶成像系统。法国Bio-profil图像分析系统。YJ-875S 超净工作台：苏州佳宝净化工程设备有限公司。7530-G 型可见紫外分光光度计：费尔伯恩精密仪器(上海)有限公司。低温离心机(TGL-18R)：上海茸研仪器有限公司。SZ-97 自动三重纯水蒸馏器：上海科晓科学仪器有限公司。BS60 三用恒温水箱：上海善志仪器设备有限公司。AE200 电子天平：上海平轩科学仪器有限公司。HJ-3 磁力搅拌器：金坛市新航仪器厂。300 度恒温烘箱：北京医疗设备厂。Gilson 1 000 μL，200 μL，10 μL自动移液器：法国Gilson 公司。低温高速离心机：上海茸研仪器有限公司。超低温冰箱：东莞市汇泰机械有限公司。电子天平：AE200 型，拓赫机电科技(上海)有限公司。手提式压力灭菌消毒器：广州蓝灵水处理设备有限公司。

1.2 实验方法 动物分组、给药方式、模型建立和标本采集：健康7日龄Wistar大鼠90只，雌雄不拘，体重(21.0±3.1)g，随机分为假手术组(n=10)、HIE组(n=40)和葛根素治疗组(n=40)。以上3组又随即分为A、B两个亚组，并设假手术组为正常对照组。葛根素治疗组大鼠于模型制备前一天开始腹腔注射葛根素20 mg/kg，每日两次，直至标本采集完毕。假手术组和HIE组大鼠同步注射相同剂量生理盐水。假手术组只把颈部切开同时在左侧颈总动脉进行分离术，不需要结扎，将切口缝合之后吸入正常空气。将HIE组和葛根素治疗组建立的HIE经典模型。HIE组和葛根素组术后3 h、6 h、12 h，24 h 4个时间点各取8只，假手术组于24 h取标本。以上三组然后随机各自再分为A B两个亚组。A亚组5%水合氯醛麻醉后，经心脏4%多聚甲醛灌注固定，断头，头皮沿前自剪开颅骨，取出大脑，分离左右大脑半球。固定，脱水，透明，包埋后，于前囟前0.3 mm至前囟后0.6 mm之间连续切片，片厚5 μm，粘于处理的切片上，室温保存备。其中两张常规HE染色观察神经元细胞形态，余留免疫组化检测磷酸化Akt水平。B亚组直接断头取脑，快速剥离脑表面大血管，取左侧大脑，液氮冻存，以备western blot实验检测总Akt、磷酸化Akt(Ser473和Thr308)表达水平。

免疫组织化学染色步骤：利用二甲苯和酒精进行标本脱蜡处理，使用过氧化酶(3%)进行孵育5 min，目的是消除内源性过氧化物酶的活性。接下来需要把玻片放到枸橼酸缓冲液的容器中，放到微波炉中维持在92℃～98℃加热10 min，将抗原修复，取出之后在室温环境中冷却10 min。滴加磷酸化一抗Akt (1∶200稀释)同时被生物素标记的第二抗体，放置在37 ℃环境中孵育半小时。随后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素三抗(普通型SP试剂盒，1∶ 100稀释)，放置环境如上。最后需要滴加新鲜的DAB溶液，观察有没有显色反应，如果细胞出现棕黄色颗粒沉淀则为阳性反应，利用显微镜控制反应时间，上述处理完成之后还需要用蒸馏水进行洗涤，等到干燥之后用中性树胶封好固定。以上各步骤之间均以0.01 mol/ LPBS ( pH7.4 )漂洗5 min×3次。假手术对照组以0.01 mol/LPBS代替磷酸化Akt抗血清。

Western blot：提取保存新鲜组织中的100 mg蛋白组织放到匀浆机，然后取50 mL Tris-HCI，150 mLNaCl，1 μg/μL的1%脱氧胆酸钠，1 μg/μL的1%NP-40，1 μg/μL的1%SDS，1 μg/μLlAprotinin、Leuptin、Pepstalin 配制成裂解液后搅拌均匀。放置到转速13 000 r/min装置中离心10 min。然后，把上清液放到Ep管中，蛋白定量，并描绘出标准的蛋白曲线。然后进行图像分析；随后通过吸光度值对磷酸化的Akt进行蛋白量的调整，目的是让每对组织中的蛋白量都相同，还要利用相似的方法对磷酸化Akt(Ser473、Thr308)行western blot 检测(方法同上)，目的是找到调整后每对组织磷酸化Akt表达的差异。最后要把样本中的Akt的积分光密度值和β-actin 的积分光密度值进行比较，同时把磷酸化Akt 积分光密度值和调平后Akt 的积分光密度值比较，得出蛋白质的含量。

2 结 果

2.1 各组HIE大鼠脑组织的病理表现 HE染色显示假手术组皮层和海马区神经元结构完整，细胞排列整齐，形态正常，分布均匀，无明显神经元损伤表现。在3 h、6 h、12 h、24 h这四个时间点内，随着时间推移，HIE组皮层和海马区可见大量神经元的坏死，排列紊乱，结构不清，细胞体积缩小，胞核固缩，染色加深，形状不规则，甚至胞膜破裂，细胞解体消失；而葛根素治疗组可看到部分的神经细胞的坏死，形状不规则，核固缩，染色加深，脑组织结构及细胞层次清楚，皮层和海马区未见明显细胞丢失(见图1)。

图1 各组HIE大鼠脑组织的病理表现

2.2 葛根素对HIE大鼠皮层和海马组织中磷酸化Akt表达的影响 磷酸化Akt阳性细胞主要为胞浆着色，呈棕黄色。免疫组化的结果显示各组磷酸化Akt的表达详见表1、图2。假手术组亦有极少量表达；HIE组的阳性细胞数随时间延长而增多，在12 h达到高峰；葛根素治疗组的阳性细胞时间延长而增多，但在24 h时达到高峰。葛根素对HIE大鼠皮层和海马组织中磷酸化Akt表达的影响。

表1 葛根素对皮层和海马组织中磷酸化Akt 表达的影响

图2 葛根素对皮层和海马组织中磷酸化Akt 表达的影响

2.3 Western blot检测总Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表达的变化 造模后3 h，6 h，12 h，24 h 四个时间点HIE组与葛根素治疗组相比较总Akt的表达一致；磷酸化Akt(Thr308 和Ser473)的表达在葛根素治疗组明显高于HIE组。且葛根素治疗组磷酸化Akt的表达随着损伤后时间的延长而升高，在24 h到达高峰；HIE组Akt的表达在12 h达到高峰。详见表2、图3。

组别 Ser473 3h6h12h24h Thr308 3h6h12h24hHIE组45.89±4.2173.59±7.05119.57±10.2843.26±4.0828.26±2.5462.54±5.68107.63±9.2527.59±2.39葛根素组49.67±4.6489.68±8.45168.24±15.21204.65±18.2240.28±3.5678.64±7.23147.89±12.35182.64±15.32

图3 western blot 检测总Akt，磷酸化Akt(Ser473、Thr308)表达的变化

3 讨 论

对于新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制和治疗方法的研究，由于受到多种因素的制约，目前大多采用HIE 动物模型进行研究。对于人类来说，脑发育的高峰期是在出生时候，而新生一周的大鼠和新生儿出生时的脑发育处于相同的阶段。该实验研究对象是新生一周的大鼠，并成功建立新生儿HIE模型。脑缺氧缺血所致的病理损害由复杂的综合因素引起。研究证明，HIE的脑损伤神经元坏死包括缺氧缺血后的即刻脑死亡(脑细胞坏死)和延迟性脑损伤(以细胞凋亡为主)两个阶段[1-3]。脑细胞坏死阶段，因为能量的损耗严重，离子平衡失调，细胞中的钠离子和钙离子不断聚集，同时兴奋性氨基酸、氧自由基和NO不断地增加，最终造成细胞溶解死亡，此过程称为神经元坏死。神经元坏死的第二阶段也称为迟发型神经元坏死，一般发生在几小时之后，主要是由局部环境的刺激引起的，容易受到基因的调控发生非炎症性死亡。脑神经细胞的凋亡和HIE新生动物迟发型神经损伤具有非常紧密的联系。

脑缺血和细胞凋亡相关的信号转导通路主要包括下面几种酶物质：有丝分裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3-K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，Akt)信号通路。随着医学的发展，人们研究的不断进步，研究发现，在细胞凋亡过程中，MAPK信号通路具备双重功能，然而，PI3K/AKT信号通路依旧是重要的细胞存活信号通路，大多数神经营养因子会激活PI3K/Akt信号通路，然后对细胞凋亡产生抑制作用，并发挥神经保护作用。PI3K属于磷脂酰基醇激酶，激活之后能够使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成一系列的相关物质，如磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3P)、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸(PI-3，4-P2)和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PI-3，4，5-P3 )。后两种物质可以和Akt的PH区结合，使得一部分Akt被激活，同时使Akt转位于细胞膜的内表面。5-磷酸酶能够把磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸转化为PI-3和4-P2，进而能够使位于细胞膜内的磷脂酰激酶依赖激酶1(phosphatidylinositol dependent kinase，PDK1)和磷脂酰激酶依赖激酶2(PDK2)激活，同时这两种酶又可以把Akt激活。Akt属于重要的抵抗凋亡的调节因子，能够介导生物学效应[3]。PI3K被激活后，可以合成磷脂物质，进而使得Akt和下游的信号级联反应被全部激活，对细胞的生存、生长发育以及分化增殖产生一定的影响[4]。因此Akt磷酸化可以作为衡量PI3K活性的指标许多研究表明，PI3K/Akt信号通路与脑缺血损伤有关。有学者研究大鼠大脑中动脉闭塞90 min后磷酸化Akt和磷酸化ERK在神经元中的表达，通过采取免疫荧光方法后得到结果，对照组中磷酸化Akt阳性细胞弱表达，而模型组在缺血再灌注1 h～3 h表达上高，1 h达到高峰，而且缺血周围区要远远多于中央区[5]。磷酸化的ERK单阳性细胞核Akt/ERK双阳性细胞在一小时后也达到高峰。由此可知，缺血再灌注早期Akt和ERK信号通路都在脑缺血诱发的应激反应中发挥作用，同时这两种物质是共同发挥作用的。还有学者通过进行体外细胞培养，对缺血条件下星形胶质细胞的凋亡和磷酸化Akt和ERK之间的关系进行研究[6]，其结果发现，TUNEL阳性细胞在缺血后6 h开始出现，12 h呈现逐渐上升的趋势，但是磷酸化Akt和ERK都是在缺血后6 h～12 h表达增加，由此可说明磷酸化Akt和ERK都和缺血诱导的细胞凋亡具有一定的联系。但是还有部分研究认为Akt参与了缺血的预适应，能够对脑缺血神经元产生保护作用，而且其激活程度和脑缺血的损伤程度有密切的联系。缺血预适应主要功能是确保严重缺血情况下神经细胞的死亡，可以保护严重缺血条件下的神经细胞死亡[7]。

葛根素主要是从中药豆科植物中提取出来的，干燥根是其主要的成分，其化学名称是4，7-二羟基和8-β-D葡萄糖异黄酮。目前研究表明，葛根素可扩张脑血管，增加脑血流量和降低脑组织氧耗量，对血管内皮细胞进行调节，具有抗氧化、清除自由基以及抑制缺血再灌注损伤的作用[8-9]；葛根素对细胞凋亡具有干预作用，这说明细胞凋亡属于葛根素发挥保护效应的分子机制。现在已经有大量研究表明，葛根素的作用主要和Bcl家族因子有关，比如P53，fas，fos等，除此之外还和caspase-3信号传递途径有关。细胞凋亡的过程是非常复杂的，葛根素的影响位点以及作用途径都和其他的基因和调控因子有关联。这些问题对于相关疾病的预防以及治疗具有非常重要的意义[10]。本次实验研究的结果显示，在病理切片的HE染色皮层和海马区内可明显看到葛根素治疗组神经坏死程度较HIE组轻，脑组织的空隙中空泡逐渐减少，并出现核边集，固缩及染色体片段的神经元比HIE组少。通过免疫组化检测方法可以发现：单纯HIE组磷酸化Akt表达在损伤3 h后会随着时间的延长逐渐减少，在24 h后达到低谷。但是随着再灌注时间的延长，葛根素治疗组磷酸化Akt的表达会呈现出逐渐升高的趋势，并在24 h达到高峰，同时还会发现12 h和24 h会出现明显上升。这表明葛根素能保护HIE损伤过程中大鼠海马神经元，磷酸化Akt的表达上调可能是其重要的机制之一。为进一步证实葛根素的作用涉及PI3K/Akt途径，用western blot方法检测PI3K通路下游关键性激酶Akt(总Akt、磷酸化Akt Ser473，磷酸化Akt Thr308)的表达情况 。总的Akt表达在葛根素治疗组及HIE组之间无明显差别，但磷酸化Akt的表达在葛根素治疗组明显强于HIE组。葛根素显著提高磷酸化Akt的水平，既可作用于Ser473磷酸化位点，也可作用于Thr308磷酸化位点。故葛根素可激活PI3K/Akt通路来发挥其对HIE新生大鼠神经元的保护作用。

本次实验发现，葛根素对HIE 模型新生大鼠具有神经保护作用，可通过激活PI3K/Akt 通路来发挥其对HIE 新生大鼠神经元的保护作用。其机制可能与上调磷酸化Akt(Ser473)、磷酸化Akt(Thr308)表达水平，增加Akt 磷酸化水平的表达有关。加之已有的研究结果，葛根素可明显减轻HIE 神经元死亡，是一种较好的有广阔应用前景的神经保护剂。

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(本文编辑王雅洁)

Study on the Mechanism of Puerarin on Neurons and PI3K/Akt Signaling Pathway in Neonatal Rats with Hypoxic-ischemic Encephalopathy

Fan Shaoping，Ding Wenxue，Liang Bixian

People’s Hospital of Longhua District，Southern Medical University，Shenzhen 518109，Guangdong，China

Objective To observe the neuroprotective effect of puerarin in hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) rats model， and to investigate whether the PI3K/Akt signal pathway was involved in the neuroprotective effect of puerarin on neonate rat in HIE model and its possible mechanisms.Methods Ninety 7-day neonatal Wistar rats were randomly divided into sham operation group (n=10)， HIE group (n=40) and puerarin treatment group (n=40).The last two group were further divided into 3 h，6 h，12 h and 24 h four time points， each of them had 10 rats.Rats model of HIE were established according to Rice's and Wu Wanfang's method， then HE stain was used to observe the morphological change， immunohistochemical method and western blot were used to detect the changes of PI3K/Akt pathway， including the expression level of total Akt， phosphorylated Akt(Ser473 and Thr308)in brains of rats.Results The HIE rats model had been established successfully and 90 Wistar rats were take into the results analysis.Compared with HIE group， HE result showed that the necrotic neurons in cortical layer and hippocampus were significantly reduced in puerarin treatment group.The immunohistochemical result proved that the expression of phosphorylated Akt in puerarin treatment group was apparently increased with time going by(P<0.01).Phosphorylated Akt reached its peak after 12 h in HIE group while after 24 h in puerarin treatment group， and the expression of phosphorylated Akt in puerarin treated group was higher than that in HIE group in every time point (P<0.01).There was extremely small amount expression in sham operation group.Western blot showed that the expression level of total Akt was at equal pace between three groups in every time point.Compared with HIE group，the phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) level was increased significantly in puerarin treatment group， what's more， with time going by， the change of expression roughly conformed to the immunohistochemical result above.Puerarin could increase the levels of phosphorylated Akt by playing role on Ser473 phosphorylation site as well as Thr308 phosphorylation site.Conclusion Puerarin has neuroprotective effect on HIE rats model by activating the PI3K/Akt signal pathway.Its mechanism may be related to the up-regulation of phosphorylated Akt (Ser473 and Thr308) expression， and increased the expression of Akt phosphorylation

hypoxic-ischemic encephalopathy;puerarin;neuroprotecton；neonatal rat

国家自然科学基金(No.81370449)，项目名称：脑缺血后lncRNA调控神经元生存的机制研究

南方医科大学附属深圳市龙华新区人民医院(深圳 518109)，E-mail：szfanshaoping@163.com

引用信息：范少平，丁文学，梁碧先.葛根素对HIE新生大鼠神经及PI3KAkt信号通路的作用机制研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(6)：680-685.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.06.012

1672-1349(2017)06-0680-06

2016-08-15)