多发性硬化动物模型研究进展

彭 真，张礼标，吴 洁，孙云霄*

(1.中国药科大学生命科学与技术学院微基因药物实验室,江苏南京 210009；2.广东省生物资源应用研究所/广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东广州 510260)



多发性硬化动物模型研究进展

彭 真1,2，张礼标2，吴 洁1*，孙云霄2*

(1.中国药科大学生命科学与技术学院微基因药物实验室,江苏南京 210009；2.广东省生物资源应用研究所/广东省动物保护与资源利用重点实验室/广东省野生动物保护与利用公共实验室，广东广州 510260)

多发性硬化(MS)是一种慢性中枢神经系统自身免疫性疾病，为临床神经系统的疑难重病，对其病理过程、发病机制的研究以及治疗药物的筛选和评价都需要合适的动物模型。论文从实验动物选择、几种重要的诱导方法及模型的行为学、影像学及病理评价等多方面对MS动物模型研究进展进行介绍。

多发性硬化；中枢神经系统；免疫；动物模型

多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫性疾病，表现为局灶性炎性浸润(视神经、脑、脊髓)、脱髓鞘以及轴突损伤、胶质增生等，临床症状和病理特征极其易变。在欧美，MS是造成青壮年非创伤性残疾的主要原因，近年来发病率呈持续上升趋势，我国北方患者多于南方，以20岁～40岁居多，严重影响患者的健康和生活质量，同时也带来了巨大的社会经济影响，目前仍无法治愈。

MS涉及两种最复杂的生物学系统，免疫系统和CNS以及二者之间复杂的相互作用[1]，目前普遍认为是一种由髓鞘特异性T细胞介导的自身免疫性脱髓鞘疾病，虽然已经提出了几个发挥核心作用的遗传和环境风险因素，特异性致病机制仍未确定。

由于MS患者神经组织取样的局限性，实验动物在医学生物学研究中常常作为人类的“替身”来完成各种试验，包括疾病的发病机制研究、药物的安全性及药效评价等。本文就不同MS动物模型的诱导及模型评估等研究进展进行介绍，不同动物及不同诱导方法制备的MS模型可以从不同角度增进人们对MS致病机制的了解，通过动物模型可以探索MS的发生和发展，筛选新的治疗药物。

1 病毒模型

与遗传因素相比，环境因素可能在MS的病因中扮演着更加重要的角色，流行病学研究表明，病毒是重要的MS外部致病因素[2]。人疱疹病毒6型(Human hgerpesvirus 6,HHV-6)[3]、EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)[4]和巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)[5]都与MS密切相关。

小鼠Theiler＇s脑脊髓炎病毒[6](Theiler＇s murine encephalomyelitis virus,TMEV)是无囊膜、正单链RNA病毒，与实验性过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)相反，TMEV感染轴索损伤先于脱髓鞘(由内向外)，诱发T细胞和巨噬细胞进入CNS，导致髓鞘损伤，一般模拟慢性-渐进型MS，通常首次接种数月后才表现出行为症状，且各项指标与人类MS均十分相似，比EAE模型更接近临床。此外，塞姆利基森林病毒[6]、鼠肝炎病毒[7]、犬瘟热病毒[8]、维斯纳病毒[9]等都能诱发MS模型，诱导CNS髓鞘损伤。病毒模型对实验室条件要求极高，目前尚只能在小鼠中诱导，国内该模型使用较少。

2 化学毒素模型

化学毒素诱导模型与其他模型相比并没有表现出MS临床症状，主要适合髓鞘脱失和再生机制的研究。常用的有3种试剂，即双环己酮草酰二腙(cuprizone)、溴化乙锭(ethidium bromide,EB)和溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)。双环己酮草酰二腙是一种铜离子螯合剂，可导致线粒体复合物Ⅳ功能紊乱，对CNS少突胶质细胞有选择性毒性，喂食双环己酮草酰二腙的小鼠发生慢性脱髓鞘，正常饮食后髓鞘恢复再生[10]。EB能破坏少突胶质细胞核内DNA结构，引发胶质细胞死亡最终导致脱髓鞘[11]。LPC是磷脂酶A2激活剂，在CNS中能诱导急性、可再生性脱髓鞘，对邻近细胞和轴索没有损伤[12]。

近年来，诱导少突胶质细胞凋亡的遗传手段也用于研究脱髓鞘和髓鞘再生[13-14]，使自杀基因在少突胶质细胞中选择性表达，注射诱导剂(如白喉毒素A)可诱导其凋亡。该方法虽处于初期阶段，但如果可以启动免疫系统识别髓鞘抗原，将是一次重大革新。

3 EAE模型

EAE模型是目前最常用的MS动物模型，髓鞘自身抗原特异性激活脑部辅助T细胞，使CNS发生炎性浸润，髓鞘脱失。EAE动物可发生白质和深灰质脱髓鞘，生化、免疫及病理特征都与MS非常相似，因此被普遍用于MS的致病机制及临床前研究[15-16]。国际上将EAE按临床病程分为4种类型[15]，即急性单项型(acute monophasic,AM)、复发缓解型(relapsing remitting,RR)、慢性进展型(chronic progressive,CP)、迁延复发型(progressive relapsing,PR)。

3.1 自身抗原诱导的EAE模型-经典MS模型

Rivers T M等[17]首次用兔脑提取液免疫猴子，致急性播散性脑脊髓炎，后来多用同源猴脑白质匀浆，由于匀浆抗原成分复杂，限制了细胞分子水平的研究，目前常用的自身致敏物质[18]包括髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、蛋白脂质蛋白(proteolipid protein,PLP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)以及一些合成的多肽序列如rhMOG1-125[19]和MOG35-55[20]肽段，新型免疫原如神经束蛋白NF155、NF186[21]、暂时性轴索膜糖蛋TAG-1[22]和其他一些完全非髓鞘抗原成分也不断被人们发现。

免疫诱导EAE模型涉及多种复杂因素，必须正确选择实验动物和免疫原，合理选择免疫剂量和方式，正确处理其他因素如佐剂、给药间隔时间、实验操作等。

3.1.1 动物品系、年龄和性别 啮齿类是临床前研究的常用模型，研究背景清楚且价廉易得，以Lewis、SD大鼠、SJL/J、C57/BL6小鼠等应用最为广泛，大鼠较小鼠敏感性高，发病率高，稳定性好，尤其Lewis大鼠最为敏感，但小鼠病理特征与人MS更相似[23]。

常用于EAE研究的非人灵长类动物(Non-huamn primate,NHP)有恒河猴(Macacamulatta)、食蟹猴(Macacafascicularis)和普通狨猴(Callithrixjacchus)[24]。普通绒猴是最小的新世界灵长类动物，繁殖率高，同人有相似的疾病易感度，且与人细胞因子或激素有交叉反应性[25]，在自身免疫性疾病、神经科学等研究领域都是理想的动物模型。目前国外多用普通狨猴做EAE模型，已开发了具有种系传递性的转基因狨猴，但狨猴价格昂贵，对外界环境异常敏感。猕猴属(Macaca)与人类基因同源性高达97%[26]，早在20世纪初国际研究工作者就将恒河猴作为MS模型[17]，印度等国禁止恒河猴出口后便难以满足实验需求，同属猕猴属的食蟹猴由于个体小，繁殖周期短，性格温顺，饲养成本低，易操作，节约供试品等优点，有望取代恒河猴成为更有前景的实验动物模型。我国在食蟹猴研究领域已处于国际领先地位，食蟹猴基因组测序已由华大基因主导完成[26]，各种MRI技术、转基因技术、胚胎干细胞技术和诱导多功能干细胞技术也取得了显著进展，黄行许等采用最先进的TALEN和CRISPR/Cas9技术对食蟹猴基因组进行精确编辑成功构建出基因工程猴[27-28]。

幼龄动物比成年动物病程短，发病较快但病理检测不明显，因此多选用中青年动物。多数情况下，雌性动物较雄性敏感，临床症状相对严重，有研究发现MOG免疫C57BL/6小鼠和食蟹猴时，雌雄无显著差异[29,19]。

3.1.2 免疫原 不同抗原诱发不同的自身反应性T细胞，模拟不同的EAE动物模型亚型，用于研究不同的MS致病机制、临床表现及治疗效果。MBP免疫Lewis大鼠诱发AM-EAE，此模型病程短，炎症反应明显，以急性脑脊髓炎病变为主，脱髓鞘不明显，可完全恢复；PLP139-151致敏SJL/J小鼠建立RR-EAE模型；MOG或MOG35-55肽段免疫C57/BL6小鼠建立的不可逆CP-EAE模型是优秀的MS模型，脱髓鞘和轴突损伤明显，炎症反应轻；用同源猴脑白质匀浆致敏的食蟹猴EAE模型包括AM型、RR型、CP型。

抗原剂量与发病率和病程密切相关，小剂量多次比单次大剂量免疫效果好，李康宁等[30]用不同剂量MOG35-55多肽皮下注射诱导C57BL/6小鼠EAE，发现小剂量组在神经功能评分及病理学改变等方面均更明显。

3.1.3 免疫方式和佐剂 皮下及肌肉注射不易诱导机体产生耐受，注射部位有脚垫、尾部、背部、股腹沟、腋窝等。伴随腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)破环血脑屏障促进反应性T细胞迁入CNS，并分泌细胞因子诱导淋巴细胞产生，已被广泛用于EAE模型建立。佐剂是诱发EAE所必需的，抗原用PBS稀释后与等体积弗氏佐剂混合，制成抗原乳剂，常用完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)增强免疫原性，由于CFA含细菌抗原，歪曲细胞免疫应答，甚至导致皮肤局部坏死和肉芽肿，在科学界已引起广泛争议。Jagessar等证明用MOG34-56加不完全弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant, IFA)免疫狨猴能像MOG34-56/CFA一样，诱发临床显著的EAE[31]。佐剂与抗原乳化的过程也直接影响模型的建立，白色黏稠状、高度分散的液体抗原易被吞噬和递呈。

3.2 自发性EAE模型-自身免疫性触发模型

临床治疗的高失败率表明EAE动物模型与人仍存在差距，主要原因：人工诱导髓鞘特异性免疫应答不能模拟MS的自发性，可能会错过MS的关键致病机制；大多数形式的EAE模型是通过免疫疗法诱导CD4+T细胞反应产生，而在MS致病机制中CD8+T细胞、B细胞也发挥重要作用[32]。转基因小鼠大多携带特异性T细胞受体过表达基因如HLA-DR2(DRB1*1501,DRB5*0101), DR4 (DRB1*0401), DQB1*0602, DRB1*1501等[33-34]，特异性肽段免疫即可发展为与人MS相似的疾病[18,35](表1)，B细胞在自发性EAE中扮演重要角色，研究表明早期诱导B细胞凋亡可保护这些转基因小鼠远离自发性EAE[36]。

表1 转基因小鼠模型

4 MS模型临床评估

神经功能损伤的客观科学评价是观察模型制备成功与否的重要指标，采用两人双盲法以半定量标准[37]进行评分，NHP还需参照眼睑反射、抓握力度、是否发生自伤行为等进行更细致的评估。

MRI影像学在显示MS特异性征象，确定脑部病变的大小及空间分布，病程监测及判断预后等方面发挥重要作用，采用自旋回波(SE)或快速自旋回波(FSE)序列，常规行横轴位、矢状位及冠状位扫描。由于各研究团队所用设备、序列、参数等不同，使得文献报道结论不尽一致，在研究中应注意各检测指标的优化。

组织病理学检测、免疫学分析是研究模型病理特征、免疫机制和疾病标志物的重要手段，HE染色法观察炎性细胞浸润，快蓝( luxol fast blue,LFB) 染色观察髓鞘脱失，改良Bielschowsky法观察轴突病变，组织切片免疫组化检测T细胞、NK细胞、胶质细胞等细胞分布，ELISA分析各类细胞因子(IL-4、IL-6、IL-17、IFN-γ等)，流式细胞术鉴定各类免疫细胞(CD4+T、CD8+T、Th1、Th17、Treg、B细胞)。

5 结语

MS是一个复杂的神经系统自身免疫性疾病，在遗传基础、环境因素、临床病程、病理反应等方面均表现出高度的异质性，不同的动物品系、免疫原和诱导手段可建立不同的动物模型，发病机制也有所不同。

本文总结归纳了几种典型的MS动物模型，病毒模型比EAE模型更接近临床，但对实验室条件要求极高；化学毒素模型侧重于髓鞘脱失和再生研究；EAE模型常用自交、无特异性致病原菌株的啮齿类动物，尽管啮齿类EAE模型阐明了免疫致病机制，但是否将它们作为治疗型动物模型一直以来备受争议，很多治疗手段用于啮齿类EAE模型时效果显著，但临床评估却效果不佳甚至产生不利影响，如抗CD40单克隆抗体[38]和抗IL-12/23p40单克隆抗体[39-40]。

非人灵长类动物比啮齿类更接近人遗传背景，病理特征、免疫机制和疾病标志物等方面都和人类最为接近，有助于剖析潜在致病机制，发现新的MS治疗靶标。“人源化”小鼠进一步拉近了小鼠模型与人的距离，小鼠携带人的功能基因、细胞或组织，尽管很难将人免疫系统分子引入小鼠蛋白质组学中，但该模型在阐明MS病理和治疗特异性方面有很大的前景。此外，神经-眼科学的深入研究使视觉系统有望成为量化轴突完整性和髓鞘修复有效模型[41]。理想的动物模型应该能模拟人MS的所有特征，目前的模型仍不是非常准确，需要进一步改进，更好的反映疾病的致病机制和异质性。

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Progress on Animal Model for Multiple Sclerosis

PENG Zhen1,2,ZHANG Li-biao2,WU Jie1,SUN Yun-xiao2

(1.MinigenePharmacyLab,SchoolofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210009,China; 2.GuangdongKeyLaboratoryofAnimalConservationandResourceUtilization/GuangdongPublicLaboratoryofWildAnimalConservationandUtilization/GuangdongInstituteofAppliedBiologicalResources,Guangzhou,Guangdong,510260,China)

Multiple sclerosis(MS) is a chronic autoimmune disease in the central nervous system,and a difficult case in clinical nervous system. Appropriate animal models play a key role for the research of the pathological process and mechanisms,drug screening and evaluation.In this review,we reviewed the progress on MS models from animal selection, induction methods and the evaluation of the behavior, imaging and pathological aspects.

Multiple sclerosis;central nervous system;immunity;animal model

2016-09-22

广东省科技计划项目(2013B060300026，2016A030303037)；国家自然科学基金项目(81102358)

彭 真(1991-)，女，河南驻马店人，硕士研究生，主要从事微生物与生化药学研究。

S852.34

A

1007-5038(2017)04-0108-05

*通讯作者