中药生物碱的提取及抗炎作用研究

王梦远，郭 晓，刘晓婷，商云霞，谷新利

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003)



中药生物碱的提取及抗炎作用研究

王梦远，郭 晓，刘晓婷，商云霞*，谷新利*

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003)

为探讨自拟中药复方“宫炎净”总生物碱、简化复方总生物碱以及益母草生物碱对小鼠的抗炎作用，将实验小鼠分为生理盐水、地塞米松、复方“宫炎净”总生物碱、简化复方总生物碱以及益母草生物碱组，依据建立小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性、足趾肿胀以及肉芽肿炎症模型来评估各组药物的抗炎效果。结果表明，复方“宫炎净”总生物碱组与简化复方总生物碱能够显著抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀率、降低小鼠腹腔毛细血管通透性、抑制蛋清所致小鼠足趾肿胀率、降低棉球所致小鼠肉芽组织增生，均与益母草生物碱组差异显著(P<0.05)，并与地塞米松组差异不显著(P>0.05)。结果显示，复方“宫炎净”总生物碱组与简化复方总生物碱抗炎效果相差不大，简化复方可作为临床用药组方使用。

中药复方宫炎净；生物碱；抗炎效果

奶牛子宫内膜炎常引起产犊间期延长、产奶量降低、犊牛淘汰率增加、甚至不孕症的发生，该疾病造成的不良后果严重影响了奶牛业的发展[1]。为避免过度依赖抗菌药物疗法对牛奶的药物残留和产生耐药菌株等严重不良反应，运用纯中药复方治疗奶牛子宫内膜炎是健康又有效的方法之一，近年来的相关研究表明，中草药中的生物碱大多数有抗炎、抗肿瘤、抗癌、抗病毒等作用[2-3]。

本实验室通过前期临床试验证明，自拟中药复方“宫炎净”(主要由益母草、川芎、五灵脂、当归等组成)抗炎效果显著[4]。为对该复方有效成分进行更深一步研究，本试验以生物碱为例，通过分别提取复方“宫炎净”、简化复方(益母草、川芎、甘草)及益母草(君药)中的总生物碱，测定其对小鼠耳廓肿胀、毛细血管通透性、足趾肿胀以及肉芽肿的影响[5-8]，为中药复方“宫炎净”有效成分组方的优化研究及抗炎作用提供坚实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 中药复方“宫炎净”、君药益母草、各单味药(当归、川芎、桃仁等)，均购自石河子市医药公司。

1.1.2 实验动物 200只体重20 g±2 g雌性昆明小鼠,购自石河子大学实验动物中心。

1.1.3 药品和试剂 地塞米松,Blotopped公司产品(50-02-2)；伊文思兰，Biotopped公司产品(314-13-6)；无水乙醇(分析醇)、二甲苯(20080606)，成都市科龙化工制剂厂产品。

1.1.4 仪器设备 紫外-可见分光光度计(BLUE STAR)，北京莱伯泰科公司产品；离心机(Z36HK)，上海安亭科学仪器厂产品；旋转蒸发仪(RE-52)，上海亚荣生化仪器厂产品；8 mm不锈钢冲子；精密电子天平(BS423S)，北京赛多利斯天平有限公司产品；Biotek SynergeyTM2 多功能酶标仪(550)，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 单味药生物碱的定性试验 分别称取复方“宫炎净”各单味药50 g，浸于700 mL/L乙醇，放置24 h真空抽滤去除药渣，滤液经旋转蒸发仪减压回收后用10 mL/L的盐酸稀释，得到溶液于1 000 r/min离心2 min，收集上清液，按一定比例混入生物碱特异性检测试剂碘化汞钾试剂、碘化铋钾试剂、硅钨酸试剂、磷钼酸试剂，观察混合溶液中是否有与测试剂相对应特异性沉淀产生。

1.2.2 生物碱的提取 取复方“宫炎净”粉末50 g，简化复方粉末组合50 g，益母草粉末50 g。浸于500 mL浓度700 mL/L乙醇回流6 h，反复3次后，合并提取液，真空瓶抽滤，除去多余杂质，旋转蒸发减压浓缩至50 mL。

制备732阳离子交换树脂柱。稀盐酸调制上述各组浓缩液pH至4～5，真空抽滤，去除杂质。各组滤液分别通过阳离子交换脂柱，流出液以1 mL/管为单位，直至管中分别滴加100 mL/L硅钨酸后出现阳性反应(生物碱试剂反应)，收集去离子水洗脱液并至溶液pH呈中性后，继续用50 mL/L盐酸溶液洗脱液至生物碱试剂反应为阴性后停止，将所得溶液减压蒸干后， 即为生物碱细提物。

1.2.3 实验动物分组 实验动物按试验方案不同，随机分为4个试验组，每个试验组各50只，分别为耳廓肿胀试验组、腹腔毛细血管通透性试验组、足趾肿胀试验组以及肉芽肿炎症模型试验组。每个试验组按照处理药物不同分为5个给药组，每组10只，分别为复方“宫炎净”总生物碱组、简化复方总生物碱组、益母草生物碱组；生理盐水组；地塞米松组。正常饲喂，除肉芽肿炎症模型试验组外，其他试验各组小鼠按照地塞米松组5 mg/kg的质量/体重比，其他药物100 mg/kg的质量/体重比灌胃，每日1次，连续7 d。

1.2.3.1 生物碱对小鼠耳廓肿胀度影响 取耳廓肿胀试验组小鼠，第7天终止给药0.5 h后,每只左耳正反两侧皮肤棉签涂抹二甲苯(0.025 mL)，诱发炎症反应0.5 h，颈椎脱臼处死终止反应。从相同部位用不锈钢冲子冲下小鼠双耳耳片，称重，计算小鼠的耳廓肿胀率。

1.2.3.2 生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性影响 取毛细血管通透性试验组小鼠，第7天终止给药1 h后，尾静脉推注浓度为10 g/L伊文思蓝0.2 mL后，按照每只小鼠每1 g体重腹腔注射0.01 mL剂量的冰醋酸诱发炎症反应20 min，颈椎脱臼处死终止反应，生理盐水冲洗腹腔(5 mL/只)并收集冲洗液，于1 000 r/min离心3 min，紫外分光光度计于590 nm波长测定上清液OD值。

1.2.3.3 生物碱对小鼠足趾肿胀率影响 取足趾肿胀试验组小鼠，第7天终止给药30 min后，每只右后足皮下注射0.03 mL 10 mL/L鸡蛋清溶液诱发炎症反应4 h，颈椎脱臼处死终止反应，从踝关节处剪下双后足计算小鼠足趾肿胀率。

1.2.3.4 生物碱对小鼠棉球肉芽肿形成影响 小鼠乙醚麻醉，在无菌条件下切开两耳斜向下部，将5 mg高压灭菌棉球棉球植入皮下后缝合。术后第2天各组分别灌胃给药，连续2周，末次给药50 min后，颈椎脱臼处死终止反应，剪开术部皮肤，剥离棉球以及周围肉芽组织，70℃烘箱干燥24 h，精确称量棉球肉芽组织干重。

2 结果

2.1 生物碱对小鼠耳廓肿胀率的影响

结果见表1。由表1可知，复方“宫炎净”总生物碱组和简化复方总生物碱组均能显著抑小鼠耳廓肿胀，两组与益母草生物碱组差异显著(P<0.05)，并且简化复方总生物碱组抑制肿胀效果最好。

表1 小鼠耳廓肿胀率的影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

2.2 生物碱对小鼠腹腔毛细血管通透性影响

结果见表2。由表2可知，复方“宫炎净”总生物碱组与简化复方总生物碱组能够较好的降低小鼠腹腔毛细血管通透性，与地塞米松组差异不显著(P>0.05)；并且简化复方总生物碱组、复方“宫炎净”总生物碱组与益母草生物碱组差异极显著(P<0.01)。

2.3 生物碱对小鼠足趾肿胀率影响

结果见表3。由表3可知，复方“宫炎净”总生物碱组、简化复方总生物碱组和益母草生物碱组均能显著抑制小鼠足趾肿胀，且简化复方总生物碱组抑制效果显著优于复方“宫炎净”总生物碱组和益母草生物碱组，且与地塞米松组差异不显著(P>0.05)。

2.4 生物碱对小鼠棉球肉芽肿形成影响

结果见表4。由表4可知，复方“宫炎净”总生物碱组与简化复方总生物碱组均能降低棉球所致小鼠肉芽组织增生，与地塞米松组相比，简化复方总生物碱组差异不显著(P>0.05)。

表2 小鼠腹腔毛细血管通透性影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表3 小鼠足趾肿胀率影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

3 讨论

自拟复方“宫炎净”是以益母草为君药，川芎、当归、桃仁等组成。贾书红等[9]提取中药复方“宫炎净”中总生物碱，用于家兔子宫内膜炎的治疗，不仅收到了良好的治疗效果，并且具有用药后毒性低、无残留、休药期短等优点。当前，一些相关研究也验证了绝大多数生物碱均具有较为突出的生物活性[10]。邰晓曦等[11]提取沙棘籽粕生物碱作用于小鼠炎症模型发现，对小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性增加、大鼠足部肿胀均有显著抑制。周倩等[12]也在提取半夏生物碱用于已建立的小鼠炎症模型中，证实了半夏生物碱具有显著的抗炎效果。本试验通过提取复方“宫炎净”总生物碱组、简化复方总生物碱组、益母草生物碱作用于小鼠炎症模型发现，3个组均对小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性、足趾肿胀和棉球肉芽肿的形成有抑制作用。

表4 小鼠棉球肉芽肿形成影响

注：角标相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Values with same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

本试验证实3个组生物碱虽均能抑制这4个经典炎症模型，但复方“宫炎净”总生物碱、简化复方总生物碱抗炎效果优于益母草生物碱。黄红英等[13]在提取延胡索与不同药物配伍中总生物碱含量的测定中得到延胡索与白芷配伍总生物碱含量最高，与当归配伍次之，当单味药延胡索时生物碱含量最低。中医复方强调“君臣佐使”配伍关系，“君臣佐使”体现在不同药物的组合使用上，益母草虽为君药但仍需各味药协同增效。

通过生物碱试剂检测发现中药复方“宫炎净”中并不是每单味药都含有生物碱，筛选出含有生物碱的单味药组成简化复方。简化复方总生物碱抗炎效果略优于复方“宫炎净”总生物碱，可能由于“宫炎净”复方中所含成分比较多，结构比较复杂，相互发生协同作用，在生物碱的提取过程中发生改变，这些可能性都有待于进一步研究。

本试验证明了中药复方“宫炎净”总生物碱、简化复方总生物碱、益母草生物碱均具有抗炎效果，其中复方“宫炎净”总生物碱、简化复方总生物碱效果要明显优于益母草生物碱，因此，简化复方可作临床用药组方使用。

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[3] 周贤春,何春霞,苏力坦,等.生物碱的研究进展[J].生物技术通讯,2006,17(3):476-479.

[4] 李正国.抗奶牛子宫内膜炎复方中药的药理作用研究[D].新疆石河子：石河子大学,2009.

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[12] 邰晓曦，孙 婧，曹露晔.沙棘籽粕中生物碱的提取及抗炎镇痛作用研究[J].时珍国医国药，2013,24(5):1140-1142.

[13] 黄红英，张建华，董钰明.延胡索与不同药物配伍中总生物碱含量的测定[J].四川中医,2007(12):46-48.

Study on the Alkaloid Extract from Traditional Chinese Medicine and Anti-inflammatory Effect

WANG Meng-yuan， GUO Xiao， LIU Xiao-ting，SHANG Yun-xia， GU Xin-li

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi，Xinjiang，832003,China)

To compare the differences of anti-inflammatory effect among total compound alkaloids,simplified compound alkaloids and alkaloids ofLeonurusjaponicusof traditional Chinese medicine "GongYanJing" in mice,the mice were divided into five groups including normal saline,dexamethasone,total compound alkaloids,simplified compound alkaloids and alkaloids ofLeonurusjaponicus.The anti-inflammatory experiments adopted mouse ear swelling model,toe swelling model,celiac capillary permeability experiment and granuloma inflammation model to evaluate the anti-inflammatory effect of each treatment.The results showed tant compared with alkaloids ofLeonurusjaponicas,simplified compound alkaloids and total compound alkaloids could significantly inhibit rates of xylene-induced ear swelling and albumen-induced toe edema, suppress the hyperplasia of granulation tissue induced by cotton ball, and reduce the capillary permeability in abdominal cavity.However,there were no difference found between simplified compound alkaloids(P<0.05) and total compound alkaloids groups and dexamethasone group(P>0.05).The anti-inflammatory effect of both simplified compound alkaloids and total compound alkaloids of traditional Chinese medicine "GongYanJing" is better clinical medcine.

traditional Chinese medicine GongYanJing;alkaloid;anti-inflammatory effect

2016-12-05

新疆兵团科技支疆项目(2013AB010)

王梦远(1992-)，女，河南商丘人，硕士研究生，主要从事中草药的开发与利用研究。

S853.74

A

1007-5038(2017)04-0080-04

*通讯作者