H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

张民秀，谢芝勋，黄 莉，谢志勤，刘加波，谢丽基，邓显文，罗思思，黄娇玲

( 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001)



H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

张民秀，谢芝勋*，黄 莉*，谢志勤，刘加波，谢丽基，邓显文，罗思思，黄娇玲

( 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001)

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板，经PCR扩增得到M2e基因；利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系，构建顺次连接的多拷贝体M2e，并连接入原核表达载体pGEX-6p-1，构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒，并转化至表达宿主菌中；将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小，对蛋白进行可溶性分析；利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示，在37℃下，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、 0.25、0.5、0.25、0.75 mmol/L的IPTG诱导4 h时，表达量最高；2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9 ku；对重组蛋白进行可溶性分析显示，5种重组蛋白均以包涵体形式存在；Western blot分析显示，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应，为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。

H9N2亚型禽流感病毒；M2蛋白胞外区(M2e)蛋白；重组蛋白

H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus,H9N2 subtype AIV)的感染引起禽类呼吸道疾病及产蛋量下降乃至死亡，严重危害禽类的健康，给养禽业造成了巨大的经济损失[1]。我国依靠AIV灭活疫苗免疫有效地控制了H9N2亚型AIV的广泛传播。但Pu J等[2]研究显示，近年来，经过常规免疫的鸡群仍然发生H9N2亚型AIV的感染，并且感染病例明显增多，说明目前H9N2亚型AIV疫苗不能给鸡群提供完全而有效的保护力。Sun Y等[3]分析1994年—2008年14年间分离到的H9N2亚型AIV HA基因的遗传进化规律，发现该基因变异速度加快，并且其氨基酸有较大程度的变异;Sun Y P等[4]评价H9N2亚型AIV商品化疫苗接种效果发现，H9N2亚型AIV商品化疫苗不能对SPF鸡提供完全的保护；孟芳等[5]发现，近年来在免疫压力下的H9N2亚型AIV其年平均进化率加快，造成疫苗毒株与流行毒株不匹配，从而引起H9N2亚型AIV灭活疫苗的免疫失败。基于以上数据，研究和开发一种针对不同抗原性H9N2亚型AIV并且具有交叉保护能力的广谱H9N2亚型禽流感疫苗十分必要。因此，寻求一种能够抵抗不同抗原性的H9N2亚型AIV的通用免疫原成为不可或缺的关键点。

AIV基因组编码10个蛋白，基质蛋白2(matrix protein 2,M2)是由AIV RNA节段7所编码，是AIV表面的一种膜蛋白，而高度保守的胞外区(M2e)位于M2蛋白的N端[6-7]。Mozdaanowaka K等[8-10]研究表明，融合M2e蛋白的疫苗在免疫后能够诱导产生特异性抗体，该特异性抗体对不同亚型的人流感病毒具有有效的抵抗力。目前国外一些公司对M2e制备成的通用流感疫苗进行了研究，并在临床试验上取得了一些进展，临床试验均显示基于M2e的流感通用疫苗具有良好的安全性和免疫原性[11-12]。以上研究数据显示，M2e蛋白在流感通用疫苗的研制中可作为一种有待开发的具有应用潜力的保护性抗原。由于M2e只有24个氨基酸，其免疫原性较弱[6]，因此，本研究将H9N2亚型AIV M2基因的胞外区(M2e)构建成顺次串联的2个拷贝体(2M2e)、4个拷贝体(4M2e)、6个拷贝体(6M2e)、8个拷贝体(8M2e)和10个拷贝体(10M2e)M2e的原核表达重组质粒，并在原核系统中进行多拷贝M2e重组蛋白表达，以期获得不同程度免疫原性的M2e重组蛋白，为下一步获得高免疫原性、筛选具有通用免疫原性的重组蛋白，以及开发一种针对不同抗原性的H9N2亚型AIV并具有交叉保护能力的广谱H9N2亚型禽流感疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和感受态细胞 原核表达载体pGEX-6p-1，广西壮族自治区兽医研究所实验室保存；大肠埃希菌DH5α，北京全式金生物技术有限公司产品；BL21(DE3)，天根生化科技(北京)有限公司产品；含有M2基因的pMD-19T载体(M2-19T)，广西壮族自治区兽医研究所实验室构建，基因来源毒株A/chicken/Guangxi/116c4/2012 (H9N2)。

1.1.2 主要试剂 抗GST标签的单克隆抗体，天根生化科技(北京)有限公司产品；T4连接酶、质粒提取试剂盒、核酸凝胶回收试剂盒、蛋白质分子量标准Blue Plus Protein Marker和IPTG，北京全式金生物技术有限公司产品；ExTaq酶、T Vector pMD 19 (Simple)、BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ，宝生物工程(大连)有限公司产品；SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司产品；Western blot使用ProteinSimple公司WesTM蛋白表达分析系统完成。

1.2 方法

1.2.1 引物 用于扩增H9N2亚型AIV M2e基因的引物对为BDM2e-F和BDM2e-R及引物对CLM2e-F和CLM2e-R，引物序列见表1，引物由华大基因生物技术有限公司合成。

表1 引物信息和M2e氨基酸序列

注：下划线表示酶切位点 。

Note：Restriction enzyme digestion sites are underlined.

1.2.2 M2e多拷贝基因的构建 以M2-19T为模板，用引物对CLM2e-F和CLM2e-R扩增M2e基因，并克隆到T Vector pMD 19 (Simple) 载体，经PCR鉴定出阳性克隆菌后，送上海立菲生物技术有限公司测序，将该重组载体命名为M2e-19T-1。将M2e-19T-1经BamHⅠ内切酶酶切的大片段产物和M2e-19T-1经BglⅡ和BamHⅠ双酶切后的M2e片段进行连接，参照文献[13]的方法构建2个拷贝的重组载体，重组载体命名为2M2e-19T-1；以M2-19T为模板，利用BDM2e-F和BDM2e-R引物对扩增M2e基因，并克隆到T Vector pMD 19 (Simple) 载体，经PCR鉴定出阳性克隆菌后，送上海立菲生物技术有限公司测序，将该重组载体命名为M2e-19T-2，将M2e-19T-2经BamHⅠ内切酶酶切的大片段产物与M2e-19T-1经BglⅡ和BamHⅠ双酶切后的小片段产物M2e基因进行连接，形成2M2e-19T-2的重组载体，阳性克隆菌送上海立菲生物技术有限公司测序。

将测序正确的2M2e -19T-2的阳性菌液进行质粒抽提，将重组质粒经BamHⅠ内切酶酶切，回收大片段，同时将2M2e -19T-1重组质粒经BglⅡ和BamHⅠ双酶切，回收小片段产物即2个拷贝M2e基因，将以上大片段产物和小片段产物用T4连接酶于16℃连接30 min，构建4个拷贝M2e(4M2e-19T)重组载体，阳性克隆菌送上海立菲生物技术有限公司测序，依此方法分别构建6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T，阳性克隆菌均送上海立菲生物技术有限公司测序。

1.2.3 多拷贝M2e表达载体的构建和鉴定 分别抽提pGEX-6p-1载体、2M2e -19T-2、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T克隆菌的质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ分别将pGEX-6p-1、2M2e -19T-2、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T进行双酶切后，回收小片段产物，分别是2、4、6、8、10个拷贝的M2e片段，利用T4连接酶将2M2e、4M2e、6M2e、8M2e和10M2e片段分别连入pGEX-6p-1载体，转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性菌落，送上海立菲生物技术有限公司测序，测序正确的菌液命名为2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX。

1.2.4 2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白诱导条件的确定 将鉴定为阳性的2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液于37℃培养至OD 600 nm为0.4～0.5时，分别用终浓度为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L的IPTG在37℃下诱导4 h，收集诱导后的1 mL菌液，12 000 r/min 离心1 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次后，用30 μL PBS重悬，加入10 μL 4×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液，置于沸水中变性10 min后，进行SDS-PAGE凝胶电泳；确定IPTG浓度后，根据不同时间诱导表达(0、2、4、6、8 h)重组蛋白，按照同样的方法处理蛋白，处理后进行进行SDS-PAGE凝胶电泳。

1.2.5 表达产物的可溶性分析 分别收集10 mL经1 mmol/LIPTG诱导表达6 h后的2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液，12 000 r/min离心3 min，沉淀加入1 mL PBS重悬菌体，加入溶菌酶使溶菌酶终浓度为100 μg/mL，反复冻融菌体3次并参照文献[14] 的方法进行表达产物的可溶性分析。

1.2.6 表达产物的Western blot分析 使用1.2.5中2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX获得的包涵体悬液进行Western blot分析。将抗GST标签的单克隆抗体稀释成1∶200，按照ProteinSimple公司WesTM蛋白表达分析系统的试剂盒说明书对重组蛋白进行Western blot分析。

2 结果

2.1 M2e多拷贝基因的构建

以M2基因为模板，PCR扩增M2e片段，目的基因大小为87 bp，PCR产物电泳结果与预期大小相符(图1)。依次构建的2M2e-19T、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T重组载体，经EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定的目的基因分别为169、319、469、619、769 bp左右，与预期大小一致(图2)，并且经测序鉴定证明序列正确。

2.2 多拷贝M2e表达载体的构建和鉴定

2M2e-19T、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到原核表达重组质粒pGEX-6p-1，构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX。2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的质粒经双酶切鉴定，酶切产物与预期片段大小相符(图3)，并经过测序鉴定序列正确。

M.DNA 标准DL 500;1、2.M2e基因的扩增产物M.DNA Marker DL 500;1，2.The amplification products of M2e gene

M.DNA 标准DL 1 500;1.2M2e-19T；2.4M2e-19T；3.6M2e-19T； 4.8M2e-19T；5.10M2e-19T

M1.DNA 标准DL 5 000;1.2M2e-pGEX；2.4M2e-pGEX；3.6M2e-pGEX；4.8M2e-pGEX;5.10M2e-pGEX;M2.DNA 标准DL 1 500

2.3 多拷贝M2e重组蛋白诱导条件的确定

空载体菌液、2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液经不同浓度IPTG诱导后，SDS-PAGE电泳显示，空载体无特异性条带，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组菌分别经终浓度为0.25、 0.25、0.5、0.75 mmol/L的IPTG诱导时，表达量最高(图4～图8)，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX表达产物分别约为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9 ku。2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组菌分别经终浓度为0.25、 0.25、0.5、0.25、0.75 mmol/L的IPTG诱导，诱导4 h时表达量着色最深，说明2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的最佳诱导时间为4 h。

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1诱导4 h;2～7.依次为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h; 2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1诱导4 h;2～7.依次为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1诱导4 h;2-7.依次为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h; 2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1诱导4 h;2～7.依次为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1诱导4 h;2～7.依次为0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

2.4 重组蛋白的可溶性分析

2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX表达产物经过超声波破碎后上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析，结果显示，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重组蛋白主要位于沉淀中，以包涵体形式存在。

2.5 Western blot分析

将2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重组蛋白进行Western blot分析，结果显示2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体产生一些非特异性的杂带，但并不影响对结果的判定，5种重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体仍然具有较强的特异性反应，含空载体对照的特异性条带大小约为26.4 ku(图9)。

M.蛋白分子质量标准;1.pGEX-6p-1；2.2M2e-pGEX；3.4M2e-pGEX；4.6M2e-pGEX；5.8M2e-pGEX；6.10M2e-pGEX

3 讨论

1966年在美国威斯康星州首次分离到H9N2亚型AIV后，H9N2亚型AIV在世界范围内广泛传播[15]。我国于1994年在鸡体内首次分离到H9N2亚型AIV，随后H9N2亚型AIV在我国养禽业中广泛传播和流行[16-17]。目前，H9N2亚型AIV成为我国养禽业主要的流行毒株。根据H9N2亚型AIV HA基因核苷酸序列的遗传进化规律，H9N2亚型AIV分为北美谱系和欧亚谱系。欧亚谱系分支中包括S2-like、Y280-like、G1-like和BJ94-like等，北美谱系则包括Wisconsin-like等[18]。孟芳等[5]对1994年—2014年度国内鸡源H9N2亚型AIV的HA基因的遗传变异进行了分析，结果表明，自2005年后S2-like分支的H9N2亚型AIV成为我国H9N2优势流行毒株，并且显示病毒在疫苗免疫压力下呈现变异速度加快的趋势，这可能是造成免疫失败的主要原因。由于H9N2亚型AIV具有不同的分支，并且由于其HA基因变异快的特性，即使使用疫苗免疫后，仍然会出现H9N2亚型AIV的流行，这给H9N2亚型禽流感的防控带来了困难。

有研究表明，M2e蛋白在各个亚型的流感病毒中高度保守，M2e蛋白与流感灭活疫苗联合使用或与适当的载体连接表达后，免疫后的动物具有抵抗不同亚型人流感病毒或高致病性H5N1亚型禽流感病毒的攻击[19]，因此M2e蛋白可作为通用流感疫苗的成分加以应用。目前国内筛选针对不同抗原性的H9N2亚型AIV广谱的禽流感疫苗的研究较少，并且针对融合M2e蛋白疫苗在鸡体上的免疫保护研究也较少，本研究后期会在此基础上通过获得的多拷贝M2e蛋白，研究比较不同拷贝数M2e融合蛋白在SPF鸡或其他动物模型的免疫原性，并通过比较不同抗原性H9N2亚型AIV攻毒后的免疫保护差异来评价多拷贝M2e蛋白的免疫效果。由于M2e只有24个氨基酸，其免疫原性较弱[6]，本研究将来源于H9N2亚型AIV的M2e基因顺次串联成多拷贝体，旨在提高M2e蛋白的免疫原性。本研究成功构建了含有多拷贝(2M2e、4M2e、6M2e、8M2e和10M2e)的原核表达重组质粒，并成功在大肠埃希菌中进行诱导表达，Western blot结果表明，多拷贝M2e重组蛋白的正确表达，为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原奠定基础。

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Prokaryotic Expression of M2e Protein of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus

ZHANG Min-xiu,XIE Zhi-xun,HUANG Li,XIE Zhi-qin,LIU Jia-bo,XIE Li-ji,DENG Xian-wen,LUO Si-si,HUANG Jiao-ling

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,Nanning,Guangxi,530001,China)

The plasmid containing the full length M2 gene of H9N2 subtype AIV was used as template for M2e gene amplification by PCR method; the various numbers of copies of M2e gene were constructed using the isocaudamer enzyme ligation ofBglⅡandBamHI, and the various numbers of copies of M2e gene were connected into the vector pGEX-6p-1 forming five recombinant plasmid 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX;five recombinant plasmids were transformed into expression host strain,respectively.The bacterial liquid containing correct recombinant plasmids were induced by different IPTG concentrations and the sizes of the proteins were identified using SDS-PAGE method;the analysis of soluble protein was carried;the immuneoreactivities of five proteins were analyzed using Western blot method.The result showed that the expression levels of 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX reached the highest yield respectively under 0.25,0.25,0.5,0.25 and 0.75 mmol/L final concentration of IPTG after being cultured for 4 h at 37℃;the sizes of the recombinant proteins of 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX were 31.7,37.2,42.7,48.2 and 53.9 ku,respectively;five proteins existed in a form of inclusion body;Western blot analysis showed that the 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX proteins had a good specific reaction with anti-mouse monoclonal antibody against GST.These results lay a foundation for the further obtaining high immunogenicity protein and screening the universal immunogen.

H9N2 subtype avian influenza virus;extracellular domain of M2 (M2e) protein;recombinant protein

2016-09-03

广西科技合作与交流计划项目(14123001-8)；广西特聘专家专项经费项目(2011B020)；广西科技攻关重大专项项目(1222003-2-4)

张民秀(1986-)，女(壮族)，广西南宁人，硕士，主要从事兽医生物技术研究。*通讯作者

；S852.659.5;Q789

A

1007-5038(2017)04-0007-06