天山云杉成熟与未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导及增殖研究

伊丽米努尔，李宏

(新疆林业科学院造林治沙研究所，乌鲁木齐 830063)

天山云杉成熟与未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导及增殖研究

伊丽米努尔，李宏

(新疆林业科学院造林治沙研究所，乌鲁木齐 830063)

【目的】研究天山云杉成熟与未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导及增殖条件技术，对该树种的胚胎发生机理和建立相关的快繁技术体系奠定了基础。【方法】以带胚乳和不带胚乳的未成熟合子胚及成熟合子胚为外植体，在不同生长调节剂浓度的DCR培养基上进行诱导培养。对不同生长时期合子胚的胚性愈伤组织诱导率和增殖量进行研究。【结果】(1)添加不同生长调节剂(2,4-D、6-BA、TDZ)浓度组合的DCR培养基上诱导成熟合子胚时，20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA为最佳组合浓度，胚性愈伤组织诱导率最高，为55%。(2)对不同采样时间的三种合子胚胚性愈伤组织诱导率进行分析表明，带胚乳的未成熟合子胚(6月)为32.6%，成熟合子胚(9月)为60.6%，不带胚乳的未成熟合子胚(7月)为83.1%，7月为天山云杉胚性愈伤组织诱导的最佳采摘期。(3)胚性愈伤组织在不同5种培养基上增殖培养表明，培养基之间增殖量差异显著(P<0.05)。BM2和SH培养基的增殖效果明显优于MSG，1/2DCR，DCR，以SH的综合增殖效果最好，其增殖量为4.55 g，增殖率为600%。(4)5种个体胚性愈伤组织在SH培养基上增殖培养表明，个体之间增殖量变化不明显(P>0.05)。【结论】建立了天山云杉胚性愈伤组织发生技术平台，为天山云杉遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了研究基础。

天山云杉；培养基；生长调节剂；胚性愈伤组织

0 引 言

【研究意义】天山云杉(PiceaschrenkianaFisch. et Mey.)属松科云杉属，为中亚和亚洲中部山地特有种，在中国仅分布于天山，是新疆山区最重要的森林树种之一，面积约52.84×104hm2，占全疆天然有林地总面积44.9%[1-2]，是新疆山地森林中分布最广、蓄积量最大、经营活动最多、用途最广、材质优良的主要用材树种，对天山的水源涵养、水土保护、林区生态系统的形成和维护发挥着不可替代的作用[3]。研究天山云杉胚性愈伤组织发生及增殖培养技术，对该树种的胚胎发生机理和建立相关的快繁技术体系等具有重要意义。【前人研究进展】由于天山云杉分布区人类活动频繁及不合理的经营管理和林牧矛盾等因素造成天山云杉林生态系统结构严重受损，导致了天山云杉林的衰退[4]。天然更新不良或天然更新困难等问题的出现已成为长期困惑林业工作者的一大难题。云杉树种生长较慢，种子成熟率很低，繁殖和品种选育有很大困难[5]。从种子萌发到长成可以移栽的小苗，又需经过4～5a，所以通过自然繁殖进行育种和选择优良基因型效率太低。采用嫁接、扦插等营养繁殖的方法既消耗大量的时间和劳动力，又受季节的限制。体细胞胚发生是指在离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过程[6-8]。植物体细胞胚胎发生不仅可作为其繁育的重要手段，而且也是研究胚胎发育过程的一种重要模式系统[9-11]。【本研究切入点】目前天山云杉主要通过有性繁殖产生后代，无性繁殖一直受到各国林业决策部门的重视与林木育种工作者以及森林经营者的特别关注，尤其是现代生物技术的蓬勃发展，如植物组织培养及体细胞胚胎发生技术，具有繁殖效率高、周期短、不受自然条件制约、稳定和选育优良品种，对造林工程具有重大意义等特点[12-14]。【拟解决的关键问题】以带胚乳和不带胚乳的未成熟合子胚及成熟合子胚为外植体，研究天山云杉胚性愈伤组织诱导及增殖的完整发育过程，并对影响天山云杉胚性愈伤组织诱导的因素如种子采摘期和培养基及生长调节剂等进行研究，建立天山云杉胚性愈伤组织诱导和增殖的技术平台，为天山云杉遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

采样地点为新疆乌鲁木齐市水西沟。采样时间为：分别于2013年6月26日采集天山云杉球果(带胚乳的未成熟合子胚)、7月25日采集天山云杉球果(即不带胚乳的未成熟合子胚)、9月10日采集成熟种子(即成熟合子胚)作为材料。

1.1.3 材料不同发育阶段的合子胚的形态结构

合子胚的不同发育期是培养物诱导的一个重要因素。图1

a、b：成熟种子；c、d：成熟合子胚；e-g：未成熟球果；h-j：未成熟种子；k-l：未成熟合子胚；规格：1 mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k,l)

a、b：mature seeds; c、d：mature zygotic embryos；e-g：immature cones；h-j：immature seeds；k-l：immature zygotic embryos；Standard: 1mm(b，c，d，i，j)；100 μm (k，l)

图1 天山云杉种子及其成熟与未成熟合子胚
Fig.1 The seeds and mature and immature zygotic embryos ofP.schrenkiana

1.2 方 法

1.2.1 天山云杉胚性愈伤组织诱导培养基及制备

试验选用的诱导培养基为DCR[15]培养基。制备时，每升添加30 000 mg蔗糖+不同生长调节剂浓度组合，pH值5.8±0.02，添加3 000 mg/L Gelrite(卡拉胶)为固化剂。在121℃，2×107Pa的压力下进行15 min高压灭菌，高压灭菌后，培养基温度冷却到60℃时，添加700 mg过滤灭菌的谷氨酰胺。6种诱导培养基筛选天山云杉胚性愈伤组织诱导的最佳生长调节剂浓度组合。以DCR1培养基作为对照。表1

表1 不同生长调节剂浓度组合的DCR诱导培养基
Table 1 DCR induction medium with different growth regulator concentrations

DCR：培养基DCR：Medium生长调节剂类型Differentgrowthregulator生长调节剂比例GrowthregulatorratioDCR10μM2，4-D0μM6-BA0DCR210μM2，4-D5μM6-BA2：1DCR320μM2，4-D5μM6-BA4：1DCR420μM2，4-D10μM6-BA2：1DCR540μM2，4-D10μM6-BA4：1DCR620μM2，4-D10μMTDZ2：1

1.2.2 天山云杉胚性愈伤组织增殖培养基制备

采用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG 5种不同的增殖培养基，5种培养基均添加生长调节剂1.10 mg/L 2,4-D和0.44 mg/L 6-BA。

1.2.3 消毒与接种

1.2.3.1 种子

将种子用质量百分浓度为0.2%的HgCl2溶液消毒5 min后，用无菌水冲洗3次，接种备用；在超净工作台上用消毒摄子和解刮刀纵裂种子，分离合子胚，将合子胚接种于各种培养基上，观察胚性愈伤组织的诱导情况。

1.2.3.2 球果

将球果用质量百分浓度为0.2%的HgCl2溶液消毒10 min后，用无菌水冲洗3次。在超净工作台上用消毒摄子和解刮刀从球果中剥去未成熟种子，从侧部划开种壳，取出种仁，划破内种皮，挑开胚乳，将6月采集的未成熟合子胚同胚乳一起和7月采集的未成熟合子胚及9月的成熟合子胚接种于各种培养基上。

1.2.3.3 接种方法与条件

3种合子胚在每培养皿接种4个，重复15次，在温度23～25℃下暗培养4～10周。

1.2.3.4 增殖继代培养

每15～20 d增殖继代一次。

1.2.3.5 增殖量

每皿增殖培养基上接种0.65 mg胚性愈伤组织(分成4块接种到增殖培养基上)进行培养，重复5次。胚性愈伤组织的增殖过程在温度为(23±2)℃下暗培养与诱导阶段相同，分别为0，7，14，21，28，35，42，49，56 d后称增殖量，并统计胚性愈伤组织增殖情况。

1.2.3.6 指标测定

污染率(%)=污染外植体数量/接种外植体总量×100%；

愈伤组织诱导率(%)=产生胚性愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%。

1.3 数据统计

用Excel 2003和prism 5.0 分析软件进行差异显著性分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 3种合子胚对胚性愈伤组织的诱导过程

不同发育阶段的3种合子胚分别接种到DCR3培养基上诱导。分不同发育阶段观察记录产生愈伤组织的数量、色泽和质地，辨别其为胚性愈伤还是非胚性愈伤组织。研究表明，培养5个星期后合子胚开始形成愈伤组织(图2c)，培养10个星期后生长迅速的白色丝状透明的胚性愈伤组织(图2d，h，i)和坚硬的颗粒状黄褐色非愈伤组织(图2n，o)，随培养时间的延长后褐化死亡。一般愈伤组织分成2大类：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。胚性愈伤组织通过发育可以分化，可以形成苗木。而非胚性愈伤组织不能分化，不能形成苗木。图2

a-d：带胚乳的未成熟合子胚(未完全形成合子胚)；a：接种第1 d；b：培养2个星期；c：5个星期后种胚开始形成愈伤组织；d，h，i：培养10个星期后生长迅速的白色丝状透明的胚性愈伤组织；e：分离合子胚后的胚乳；f：不带胚乳的未成熟合子胚(合子胚胎发育阶段I)；g：成熟合子胚(合子胚胎发育阶段III)；j-m：显微镜放大后胚性愈伤组织；n，o：黄褐色非胚性愈伤组织；p：非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织；E：胚发育阶段I；S：胚根；比例尺：1 mm(a-i)；0.5mm (j, k, l, m)；3 mm (n-p)

a-d: immature zygotic embryos(ZE) without endosperm younger than Phase I; a: freshly prepared; b: after 2 Weeks of culture; c: after 5 weeks with beginning SE; d, h, i: after 10 weeks with advanced development of SE; e: open ZE with endosperm; f: isolated ZE Phase I; g: isolated ZE Phase III; j-m: Details of SE; n, o：callus formation in isolated ZE; p: Callus formation and SE; E: Phase I with embryo; S: Suspensor; Scale bar: 1 mm (a-i); 0,5 mm (j, k, l, m); 3 mm (n-p)

图2 天山云杉胚性愈伤组织诱导的显微下观察
Fig.2 Observation Microscopy of induced somatic embryogenesis (SE) ofP.Schrenkiana

2.2 6种诱导培养基对成熟合子胚胚性愈伤组织诱导

天山云杉成熟合子胚在6种培养基上诱导培养。研究表明，在DCR6和DCR3培养基上诱导率较高，分别为45%和55%。在DCR5和DCR4培养基的诱导率较低，分别为35%、32.5%。在DCR2培养基上诱导率最小为18%。通过方差分析的结果表示，DCR6和DCR3比其他培养基之间差异显著(P<0.05)。表现出生长调节剂浓度组合的优势。其他培养基之间的差异不显著(P>0.05)。6种培养基诱导率的高低排序为DCR3> DCR6> DCR5> DCR4> DCR2> DCR1。图3

2.3 不同发育阶段的合子胚在DCR3上的诱导

不同发育阶段的3种合子胚分别在DCR3培养基上诱导培养。产生的胚性愈伤组织总数占接种外植体总数的百分率来表征天山云杉3种合子胚诱导胚性愈伤组织的诱导率，研究表明，7月采集的合子胚诱导率最高为为83.1%，9月采集的合子胚诱导率为60.6%，6月采集的合子胚诱导率最底为32.6%；通过非胚性愈伤组织统计结果表示，6月采集的合子胚诱导率为10.6%、7月采集的合子胚诱导率为6.8%和9月采集的合子胚诱导率为40%。诱导过程中每天统计污染率表明，9月10日采集的合子胚污染率最高，达36.5%，其他2种合子胚的污染率为5%。表3

对胚性愈伤组织诱导率进行方差分析，结果表示，不同发育阶段的合子胚对胚性愈伤组织的诱导呈显著性差异 (P<0.05)。7月采集诱导胚性愈伤组织的诱导率高、非胚性愈伤组织率低、质量好、污染少、增殖力强比其他2种合子胚。

2.4 增殖培养基对胚性愈伤组织增殖

将胚性愈伤组织接种于5种不同培养基上增殖培养，研究表明，5种培养基其增殖量与增殖率表现出不一样的变化，试验数据统计结果表示，BM2和SH培养基的增殖量高于其他培养基，分别为5.74 g和为4.55 g，增殖率达到782.7%和600%。其他3种培养基(MSG、DCR、1/2DCR)的增殖率低，分别为3.41 g、2.69 g、2.61 g，增殖率达到424.4%、313.2%、301.5%。通过原始统计数据进行方差分析、显著性检验，结果表示，BM2和SH培养基的增殖量显著差异(P<0.05)。其他3种培养基之间无显著差异(P>0.05)。增殖量的高低排序为BM>SH>MSG>DCR>1/2DCR。BM2和SH培养基的增殖效果明显优于其他3个培养基。虽然BM2培养基的增殖效果最好，但其继代一次后褐化现象严重。SH培养基继代培养后能够保持较好的胚性，褐化现象较少。在SH培养基中谷氨酰胺含量比BM培养基的一半，谷氨酰胺是一种特殊的营养物质，可能影响SH培养基的增殖率。图4

注：相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

图3 不同生长调节剂浓度组合下天山云杉胚性愈伤组织诱导率变化
Fig.3 Effects of different combinations of growth regulator concentrations on the induction rate of somatic embryogenesis ofP.Schrenkiana
表3 天山云杉种子(含球果)不同采种期的合子胚诱导产生胚性愈伤组织状况
Table 3 Induction of SE inP.schrenkianawith different collection time

采集日期AcquisitionDate接种数(个)Numberofvaccination污染死亡数(个)Pollutiondeaths剩余数(个)Remaininggrains污染死亡率(%)Pollutionmortality无反应数(个)Numberofnoreactions非胚性愈伤数(个)Non-embryogenicnumber胚性愈伤数(个)Embryogenicnumber胚性愈伤组织诱导率(%)Embryogeniccallusinductionrate201362620010190510820623262013725200101905191315883120139102007312236506067530

2.5 不同天山云杉个体胚性愈伤组织在增殖培养基上增殖变化

选取了5个天山云杉个体胚性愈伤组织(T6，T7，T36，T43，T48)，接种在SH培养基上观察增殖情况(图5B)。研究表明，5种不同个体胚性愈伤组织增殖量变化不明显(图5A)，5种个体的增殖量分别为4.63 g、4.56 g、4.50 g、4.11 g、4.09 g。高低排序为T6>T36>T48>T43>T7。通过方差分析结果表示，各个体之间增殖量无显著性差异(P>0.05)。图5

注：相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)

Note: same letter indicate no significant difference(P>0.05), difference letter indicate significant difference(P<0.05)

图4 诱导天山云杉胚性愈伤组织增殖的最适培养基选择
Fig.4 Selection of the optimum medium for inducing somatic embryogenesis proliferation ofP.schrenkiana

注：图5B中：a、b：增殖培养基的胚性愈伤组织；c：胚性胚柄团的显微结构观察；d：胚性愈伤组织的显微结构观察, 比例尺：10 mm(a，b)；100 μm (g，d)

Note:
Fig. 5B: a，b: somatic embryogenesis Proliferation medium; c: microstructure of embryonic suspensor group; d: microstructure of somatic embryogenesis, Scale bar: 10 mm (a, b); 100 μm (g, d)

图5 不同基因型胚性愈伤组织在SH培养基上的增殖情况
Fig.5 Proliferation of different somatic embryogenesis in SH

3 讨 论

植物体胚发生是植物界普遍存在的一种现象，在快速繁殖、人工种子、种质资源保存、突变体的诱变和筛选、植物基因工程等许多方面有广阔的应用前景和巨大的潜在经济价值[16-18]。自从1958年在胡萝卜组织培养中发现了一种与胚相似的结构以来，目前能离体再生的植物达1 000多种，并有逐年上升的趋势，说明在植物界体细胞胚胎发生是一种较为普遍的现象[19]。通过体细胞胚胎发育途径实现植株再生不仅可以解决无性繁殖的问题，对于生物技术在云杉属中的具体应用及其树种的品质改良也具有十分重要的意义。在天山云杉体细胞胚胎发生过程中，经由组织培养方法诱导愈伤组织，并由愈伤组织获得体细胞胚胎，是目前人工种子研究和生物技术中广泛应用的手段之一[20-22]。

不同浓度的2,4-D、6-BA和TDZ组合对诱导胚发生愈伤组织的效率也不同[23]，因此，确定天山云杉胚性愈伤组织诱导的最佳培养基和生长调节剂浓度至关重要。添加不同浓度的2,4-D和6-BA或TDZ的DCR培养基上诱导成熟合子胚时，20 μM 2,4-D 和5 μM 6-BA为最佳生长调节剂浓度组合，胚性愈伤组织诱导率最高，达到55%。这与孙敬爽等[24]研究的北美蓝云杉体细胞胚胎发生的生长素浓度相比浓度较低，进一步说明不同种类的云杉体细胞胚胎发育的需要的生长素浓度不同。不同发育阶段的3种合子胚分别在DCR3(20 μM 2,4-D和5μM 6-BA)培养基上诱导培养表明，带胚乳的未成熟合子胚(6月26日)为32.6%，成熟合子胚(9月10日)为60.6%，不带胚乳的未成熟合子胚(7月25日)为83.1%。不同发育阶段的合子胚对胚性愈伤组织的诱导呈显著性差异，6月采集的合子胚在诱导过程中，54%的合子胚没有反应，诱导率低于7月采集的合子胚。而9月采集的合子胚污染率和非胚性愈伤组织率高，分别为36.5%和30%，诱导率低于7月采集的合子胚。7月采集的合子胚污染率低，诱导率高，增殖力强，胚性愈伤组织诱导的最佳采摘期。这与Carneros[25]，等得到的结论一致。为今后体细胞胚胎发育研究奠定了基础。通过天山云杉种子成熟的不同发育阶段(带胚乳的未成熟合子胚，不带胚乳的未成熟合子胚，成熟合子胚)的胚性愈伤组织的诱导是完全可能的；天山云杉胚性愈伤组织的诱导率的高低与种子采摘时间密切相关。

供试的5种培养基对胚性愈伤组织的增殖效果不同，BM2和SH培养基的增殖效果明显优于MSG，1/2DCR，DCR。其中BM2培养基的胚性愈伤组织增殖效果最为明显，其增质量达到5.74 g，但BM2增殖的胚性愈伤组织增殖效果最好，但其继代一次后易褐化。不同基础培养基上的不同胚性愈伤组织的增长量表明，BM2增殖培养基上的不同胚性愈伤组织的增殖量最高，其次是SH培养基，愈伤组织增殖量为4.55 g，增殖率达到600%。由于以SH为基本培养基进行增殖培养的胚性愈伤组织在继代培养后能够较好的保持胚性，且继代后褐化现象较少。获得良好增殖的胚性愈伤组织，外观颜色呈现淡黄色，增殖培养1～2个月后，有的愈伤组织会出现一些褐变，因此，为提高胚性愈伤的增殖倍数，如何延长增殖培养时间以及如何促进和提高增殖培养的倍数，则是其后的研究需要进一步深入的研究课题。这与Klimaszewska[26]等研究结论一致。

研究对影响天山云杉胚性愈伤组织诱导的因素如种子采种期、培养基和生长调节剂等进行探讨，并建立了天山云杉胚性愈伤组织发生技术平台。天山云杉胚性愈伤组织的诱导与增殖的可行性，为研究天山云杉遗传改良种质创新和缩短育种周期奠定了坚实基础。

4 结 论

4.1 以天山云杉成熟合子胚诱导胚性愈伤组织，DCR作为基础培养基添加20 μM 2,4-D和5 μM 6-BA(4:1)为最佳培养基，胚性愈伤组织诱导率最高，达到55%。

4.2 3种不同发育阶段的合子胚在DCR3培养基中，7月25日采集的未成熟合子胚的诱导率最高，达到83.1%，为胚性愈伤组织诱导的最佳外植体。

4.3 在BM2、SH、MSG、1/2DCR、DCR 5种培养基中，SH是增殖胚性愈伤组织的综合增殖效果最佳，增殖量从0.65 mg提高到4.55 g，增殖率为600%。

4.4 不同个体胚性愈伤组织在SH培养基上增殖培养，表明个体之间增殖量变化不明显。

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Supported by:Supported by Natural Science Fund of Xinjiang Uygur Autonomous Region"Related research on the somatic embryogenesis of Picea schrenkiana"(2013211A036)

Study on the Induction and Proliferation of Somatic Embryogenesis from the Mature and Immature Zygote Embryos ofPiceaschrenkiana

Yiliminuer，LI Hong,

(ResearchInstituteofAfforestationandDesertificationPreventionandControl,XinjiangAcademyofForestrySciences，Urumqi830063,China)

【Objective】 To study the induction and proliferation of somatic embryogenesis from the mature and immature zygote embryos ofPiceaschrenkiana, which might have great significance for the understanding of the mechanism of embryonic development and the establishment of rapid propagation system.【Method】Immature embryo and mature embryo were used as explants to induce culture in DCR medium with different growth regulator concentrations. The induction rates of zygotic embryos in different growth stages and its proliferation were studied using immature zygotic embryos with endosperm, immature zygotic embryos without endosperm and mature embryos as explants.【Result】(1) When DCR medium added with different concentrations of 2,4-D and 6-BA was used to induce mature zygotic embryos, the combination of 20 μM 2,4-D and 5 μM 6-BA was the best and somatic embryogenesis induction rate was the highest, up to 55%. (2) The induction rate of three zygotic embryos of somatic embryogenesis collected in different periods showed that the immature zygotic embryos with endosperm (June) was up to 32.6%, the mature zygotic embryos (September) was up to 60.6%, Immature embryo without endosperm (July) was 83.1%, which indicated that July was the best picking period ofP.schrenkianacones. (3) The somatic embryogenesis in the five different proliferation medium showed the the proliferation rate was significant (P< 0.05). The proliferation results of somatic embryogenesis in different proliferation medium showed that the effect of BM2 and SH were better than the MSG, 1/2DCR, DCR, and the comprehensive proliferation effect of SH was the best. The proliferation rate was 4.55 g and the rate was up 600%.) (4) The five different somatic embryogenesis in SH proliferation medium showed that the difference between somatic embryogenesis was not significant (P> 0.05).【Conclusion】This study has established the somatic embryogenesis technology platform ofP.schrenkianafor the first time, which has provided a scientific basis for the genetic improvement of germplasm and shortened the breeding cycle ofP.Schrenkiana.

Piceaschrenkiana; culture media; plant growth regulator; somatic embryogenesis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.008

2016-11-23

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目“天山云杉体细胞胚胎发育的相关研究”(2013211A036)

伊丽米努尔(1964-)，女，塔城人，副研究员，博士，研究方向为逆境生理生态、良种选育等，(E-mail)1045230278@qq.com

李宏(1962-)，男，伊犁人，研究员，博士，研究方向为森林培育等，(E-mail)1900284827@qq.com

S791.18

A

1001-4330(2017)02-0262-10