宽频带白噪声暴露对巴马香猪和豚鼠听力损伤的影响
2017-04-13侯琨吴南塞娜王方园唐朝颖史询贝李佳楠陈立伟杨仕明
侯琨吴南塞娜王方园唐朝颖史询贝李佳楠陈立伟杨仕明
1解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室（北京100853）2福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）
·基础研究·
宽频带白噪声暴露对巴马香猪和豚鼠听力损伤的影响
侯琨1吴南1塞娜1王方园1唐朝颖1史询贝2李佳楠1陈立伟1杨仕明1
1解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室（北京100853）2福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,福建省耳鼻咽喉研究所（福州350005）
目的 通过120dB SPL宽频带白噪声对巴马香猪和豚鼠各进行单次3小时的暴露，观察比较该种噪声对两种模型动物听力损伤的特点，找到更适用于研究噪声性听力损伤的动物模型。方法选取8只6月龄ABR听阈正常的巴马香猪，和8只5～6周龄ABR听阈正常的豚鼠，设置4个ABR测听记录点：噪声暴露前，噪声暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7）。全部测听结束后，取材制作耳蜗标本，进行扫描电镜观察形态。结果通过统计学分析，豚鼠组在120dB SPL宽频带白噪声暴露后即刻的ABR阈值与暴露1天的ABR阈值具有明显差异，具有统计学意义，而巴马香猪组则无明显统计学差异。豚鼠组在噪声暴露前和噪声暴露后7天的ABR阈值无明显统计学差异，而巴马香猪组却有明显的统计学差异。相对于豚鼠，巴马香猪耳蜗标本扫描电镜提示了更多的纤毛异常。结论120dB SPL宽频带白噪声暴露会对巴马香猪和豚鼠造成一定程度的听力损伤。其中巴马香猪较豚鼠表现更为明显的听力损失，且毛细胞出现了更多的病理改变，由此本研究表明在120dB SPL宽频带白噪声单次暴露3小时的条件下，巴马香猪是一个更适于白噪声与听力损伤的研究的动物模型，从而可以更好地为噪声性耳聋提供动物模型。
白噪声；巴马香猪；豚鼠；动物模型；毛细胞
Foundation item：the National High-tech R&D Program of China for Young Scientists(2014AA020510);the National Basic Research Program of China(973 Program)(#2012CB967900);Innovation Driving Power Project of China Association for science and technology（2016CXQD01）.
Authors would like to declare no conflicts of interest.
噪声性耳聋（noise-induced deafness），亦可称之为噪声性听力损伤（noise-induced hearing loss），作为对影响现当代社会人类健康的一项疾病[1]，其主要诱因为长期暴露于损害性噪声环境中，导致以内耳毛细胞损伤为主要表征的进行性感音神经性耳聋[2-4]。随着近年来科学技术的迅速发展，对于极重度感音神经性耳聋，人工耳蜗治疗已经表现出巨大的优势。而关于人工耳蜗植入是否适用于噪声性耳聋，目前还没有较为完善的实验动物研究，主要原因受限于噪声研究动物模型的体型大小[5,6]。
生物医学研究的进展在很大程度上依赖于运用动物模型进行实验和运用动物模型对临床假说的实验验证。中国巴马香猪是一种重要的经济猪品种。因其平均寿命超过十年，有利于实验的长期进行与观察，且其解剖结构和病理生理特性与人类非常相似，尤其是内耳各器官的解剖结构与人类很相似，体积相对较大，在形态学、分子生物学研究方面更加直观，被用于多种生物医药的研究中[7-9]。哺乳纲啮齿目豚鼠科豚鼠由于引进时间较长，饲养繁殖技术成熟，繁殖率高，遗传背景清楚，动物体型较小，易操作，也被应用于生物医学研究中的各个领域[10-12]。
因此本研究以巴马香猪和豚鼠为实验对象，比较在120dB SPL白噪声暴露3小时后对两种动物的听力的影响，以及暴露后两者动物听力的恢复情况，以期明确巴马香猪除解剖学外，其生理学特征是否也更适于成为噪声性听力损伤治疗研究的动物模型。
1 材料与方法
1.1实验分组
选取6月龄，体重10～20kg雄性巴马香猪8只（由第三军医大学实验动物中心提供），外耳道洁净，实验前进行听性脑干诱发电位（Auditory Brain⁃stem Response,ABR）听阈检查，筛选出ABR听阈正常的巴马香猪8只，随机分成一个形态对照组，三个实验组，设置4个ABR测听记录点：噪声暴露前，噪声暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7），对照组为各噪声组噪声暴露前巴马香猪本身。选取5～6周龄，体重140～150g普通级雄性豚鼠（由解放军总医院实验动物中心提供），排除中耳及内耳疾病，并进行ABR听阈检测，筛选出ABR听阈正常的豚鼠8只。设置四个测听时间点：噪声暴露前，噪声暴露后即刻（P0）、1天（P1）、7天（P7）。对照组为各噪声组噪声暴露前豚鼠本身。所有实验操作均得到中国人民解放军总医院动物伦理委员会的批准。
1.2 噪声暴露
采用120dB SPL的宽频带白噪声（broad-band white noise）分别对ABR听阈正常的巴马香猪和豚鼠进行单次3h的暴露。噪声暴露期间，实验动物可在笼中自由活动，扬声器置于笼子正上方，每次仅进行一只实验动物的暴露。噪声暴露前采用标准声级计对声音强度进行校准，校准时声级计探头置于笼内进行，声音在笼子内各部位的声强变化小于1dB。暴露后实验动物送至实验动物中心进行分笼饲养至相应时间点。
1.3 ABR听阈检测
采用美国TDT测听设备对实验动物进行ABR阈值检测。每只实验组实验动物在噪声暴露前及噪声暴露后分别进行一次ABR阈值检测，测听过程在隔音屏蔽室进行。巴马香猪使用3%戊巴比妥（1mg/kg）耳缘静脉注射进行麻醉，豚鼠使用3%戊巴比妥（1mg/kg）腹腔注射进行麻醉。麻醉满意后，将记录电极置于实验动物两侧耳廓前缘连线中点皮下，参考电极置于测试耳耳垂，接地电极置于对侧耳耳垂，测试耳机距外耳道口约0.5cm，检测实验动物双耳ABR阈值。刺激声采用短声（Click），带通滤波为300～3000 Hz，叠加1024次，扫描10ms。刺激声强度从90dB开始，以10dB逐渐递减，直至检测不出重复的ABR波形，再向上增强5dB，直至能检测出重复的ABR波形，此刺激声强度即为实验动物的听阈。测听时注意动物保温。
1.4扫描电镜耳蜗标本制备
7天测听结束后，麻醉处死实验动物，迅速将其断头，快速取出耳蜗，将耳蜗放入盛有2.5%戊二醛溶液的培养皿中。在解剖显微镜下，用细针在蜗顶钻孔，并开放圆窗和卵圆窗。用2.5%戊二醛溶液自蜗顶进行灌流，冲出淋巴液。将已灌流的耳蜗标本置于2.5%戊二醛溶液溶液中继续固定，4℃冰箱过夜。解剖显微镜下仔细剥离，暴露基底膜，锇酸处理，脱水，干燥，真空喷镀。扫描电镜下观察内外毛细胞的变化。
1.5 统计分析
为了减少个体差异及实验误差等因素对实验动物本底听阈的影响，故本实验采用自身对照的配对设计思路，即将每组实验动物暴露后即刻的ABR阈值与暴露1天的ABR阈值进行配对，噪声暴露前和噪声暴露后7天的ABR阈值进行配对，实验动物的ABR阈值以均数±标准差（±s）表示，资料分析采用SPSS 19.0统计软件，进行分析值分析选用配对样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1噪声暴露后豚鼠和巴马香猪的ABR阈值变化情况
表1在120dB SPL宽频带白噪声噪声暴露3小时后，豚鼠和巴马香猪组均在不同频率上出现了听力损失，但1天后的ABR检测提示，豚鼠的听力有所恢复，暴露后即刻与1天后的各频率ABR阈值比较，P值均小于0.05，即在暴露后1天内，豚鼠的听力恢复具有统计学意义。而巴马香猪暴露后即刻与1天后各频率阈值对比发现，P值均远大于0.05，说明在暴露1天内，巴马香猪无统计学意义的听力恢复。
表1 巴马香猪噪声暴露前后ABR阈值（±s，n=16，dB SPL）Table 1 ABR thresholds of miniature pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）
表1 巴马香猪噪声暴露前后ABR阈值（±s，n=16，dB SPL）Table 1 ABR thresholds of miniature pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）
*P＜0.05 means statistic difference
before noise Seven days after t value P value Click 39.67±2.21 49.00±7.12 -5.0021＜0.0001*2 kHz 38.00±3.56 45.33±6.45 -3.9798 0.0004*4 kHz 39.33±4.42 56.00±10.52 -5.8436＜0.0001*8 kHz 37.67±6.67 51.67±9.07 -4.9740＜0.0001*16 kHz 38.67±3.86 48.67±6.45 -5.3397＜0.0001*24 kHz 40.33±4.64 51.67±5.37 -6.3915＜0.0001*24 kHz 68.67±4.27 68.00±5.72 0.3755 0.3550 Immediately after one day after t value P value Click 69.00±2.71 68.00±3.56 0.8940 0.1892 2 kHz 68.33±3.94 67.33±5.44 0.5955 0.2780 4 kHz 70.67±4.03 70.00±4.83 0.4260 0.3366 8 kHz 70.00±2.58 68.67±4.27 1.0664 0.1474 16 kHz 67.67±4.03 66.33±5.31 0.8041 0.2138
表2 豚鼠噪声暴露前后ABR阈值（±s，n=16，dB SPL）Table 2 ABR thresholds of guinea pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）
表2 豚鼠噪声暴露前后ABR阈值（±s，n=16，dB SPL）Table 2 ABR thresholds of guinea pigs before and after noise exposure（±s，n=16，dB SPL）
*P＜0.05 means statistic difference
before noise Seven days after t value P value Click 22.00±5.11 24.33±4.83 -1.3255 0.0975 2 kHz 31.33±4.92 32.00±4.15 -0.4164 0.3401 4 kHz 25.67±3.76 26.00±5.57 -0.1964 0.4228 8 kHz 22.83±2.58 23.33±4.63 -0.3773 0.3543 16 kHz 30.67±3.16 32.33±8.21 -0.7548 0.2281 24 kHz 30.33±2.76 31.67±6.21 -0.7887 0.2182 24 kHz 86.00±8.13 36.00±5.62 20.2360＜0.0001*Immediately after one day after t value P value Click 75.00±6.19 31.67±5.67 20.6472＜0.0001*2 kHz 82.33±7.05 40.67±6.47 17.4148＜0.0001*4 kHz 85.67±6.80 37.33±5.92 21.4466＜0.0001*8 kHz 83.33±6.51 30.67±5.03 25.6040＜0.0001*16 kHz 86.67±7.97 36.67±5.68 20.4355＜0.0001*
表2对比两种动物噪声暴露前与暴露后七天的ABR阈值发现，豚鼠在噪声暴露后，7天的正常饲养环境恢复后，其听力损失与暴露前各频率对比，P值均大于0.05，其差异无统计学意义，即7天的恢复使豚鼠的听力与噪声暴露前无明显差异。而巴马香猪在7天后，其听力损失与暴露前对比，P值均小于0.05，具有统计学差异，即巴马香猪在7天的恢复后，其听力依然较暴露前有损失。
表3中我们可以看到，在噪声暴露后1天和7天后，巴马香猪的click-ABR阈移占暴露后即刻阈移均明显大于豚鼠，即在1天和7天的正常环境饲养后，巴马香猪的听力损失依然保持着噪声暴露带来的听力损失。
2.2噪声暴露后豚鼠和巴马香猪的毛细胞损伤情况
通过对豚鼠和巴马香猪暴露后第7天测听结束取耳蜗制作标本，进行扫描电镜进行对比观察。图2中的图A为豚鼠耳蜗基底膜，依次为底、中、顶回，仅见少数纤毛脱落，并未观察到明显的毛细胞纤毛损伤，而在图B，即巴马香猪耳蜗标本上，在顶、中、底各回均观察到了明显的毛细胞病理改变。
图1 豚鼠与巴马香猪耳蜗静纤毛扫描电镜对比图Fig.1 scanning electron microscopic observation of the stereocilia in guinea pig cochlea and bama miniature pig
3 讨论
人类疾病的研究通常很复杂，临床研究得到的经验与数据往往难以在疾病的发生发展规律上进行深入研究，而实验动物模型的出现，可以更加有效地帮助人类认识疾病，研究疾病，研究防治策略[13,14]。在先前的耳聋研究中，通常采用啮齿类动物作为动物模型[15,16]，但是其个体小，耳蜗解剖结构与人类差距较大，无法进行人工耳蜗植入等相关治疗研究。而小型猪无论在进化关系上，还是解剖学结构上都与人类拥有较强的相似性[17-19]，且在伦理学及生物学数量上，都更为适合，所以小型猪可能是最佳的耳科领域研究动物模型。
本研究拟通过对巴马香猪及豚鼠进行白噪声造模，比较噪声后听力ABR阈值的恢复情况，发现巴马香猪在噪声后听力阈值发生明显变化，即在本实验噪声条件刺激下，巴马香猪产生了更加明显的听力损失。而在噪声后不同时段，通过对比白噪声暴露后即刻的ABR阈值与暴露1天的ABR阈值以及噪声暴露前和噪声暴露后7天的ABR阈值两组数据的统计分析，可以发现豚鼠在120dB SPL宽频带白噪声单次暴露3小时的条件下，比巴马香猪更快、更好地恢复听力，这对我们实验研究动物造模是不利的，在该条件噪声下，巴马香猪可以较久地维持噪声暴露后带来的听力损失，其阈移随时间增加，与噪声暴露即刻相比，所占百分比恢复慢，选择巴马香猪造模，可以等到更持久稳定的动物模型。
此外，猪和人类在出生后即有听力，人的听觉频率范围大致在20Hz-20KHz，而猪的听觉频率范围较人的更广，高频可达48KHz水平，而鼠类在高频频率可达到100KHz[2,6]，通过对比可以发现，猪作为听觉研究动物模型，其听觉频率范围与人类较啮齿类动物更为接近。
我们的研究对比在听力暴露后7天，对ABR进行测听结束后，迅速处死取材，制作扫描电镜标本，发现豚鼠内外毛细胞未发现明显损伤，而巴马香猪内外毛细胞可见明显损伤。本课题组前期研究发现猪的基底膜同样具有四排毛细胞，此外，在扫描电镜下可观察到毛细胞从底转到顶砖螺旋式排列，与人类极为相似。而猪的耳蜗大小也与人类及其接近，这为听觉植入的临床研究提供了非常理想的动物模型，目前已经有诸多关于人工听骨、振动声桥、人工耳蜗植入的相关研究报道。此外也为临床医生的耳外科手术操作教学提供了重要的实验动物。
表3 噪声暴露后不同时刻click-ABR阈移比较（，n=16，dB SPL）Table 3 comparison of click-ABR thresholds shifts（TF）after exposure in different time points（，n=16，dB SPL）
表3 噪声暴露后不同时刻click-ABR阈移比较（，n=16，dB SPL）Table 3 comparison of click-ABR thresholds shifts（TF）after exposure in different time points（，n=16，dB SPL）
Immediately TF Percentage Immediately 1day after Percentage 1day after 7day after Percentage 7day after miniature pigs guinea pigs 30.33 53.00 100% 100% 29.33 9.67 96.70% 18.25% 10.33 2.33 34.06% 4.40%
本实验从电生理及形态上对比了巴马香猪及豚鼠对噪声的听力学损伤及形态损伤对比，表明巴马香猪在本研究条件下，相比豚鼠，可以得到更加稳定、理想的噪声性耳聋动物模型，可以更高效地完成实验动物造模，为相关治疗研究创造实验动物。
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Effects of White Noise Exposure on Hearing in Bama Miniature Pigs and Guinea Pigs
HOU Kun1，WU Nan1,SAI Na1,WANG Fangyuan1,TANG Chaoying1,SHI Xunbei2, LI Jianan1,CHEN Liwei1,YANG Shiming1
1 Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Institute of Otolaryngology, Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China 2 Department of Otolaryngology,Affiliated First Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China Corresponding author:YANG Shiming Email:yangsm301@263.net
Objective To find a more suitable animal model for investigating the noise-induced hearing loss by comparing the effects of 120 dB SPL white noise exposure for three hours on the hearing in bama miniature pigs and guinea pigs.Methods Auditory brainstem response(ABR)in 8 bama miniature pigs and 8 guinea pigs with normal hearing was tested before exposure,immediately(P0),1 day(P1)and 7 days(P7)after exposure.Cochlear specimens were observed using scanning electron microscopy.Results The ABR threshold showed a statistically significant difference between the immediate group and P1 group in guinea pigs,but not in bama miniature pigs.There was a statistically significant difference between the immediate group and P7 group in bama miniature pigs,but not in guinea pigs.Furthermore,the bama miniature pigs showed more severe cochlear hair cell damages than that in guinea pigs.Conclusions The bama miniature pig cochleae are more vulnerable to 120 dB SPL white noise exposure,with more profound hearingloss and more severe pathological changes.The results suggest that bama miniature pig could be a more suitable animal model for noise-induced hearing loss study.
White noise;Bama miniature pig;Guinea pig；Animal model;Hair cell
R764
A
1672-2922（2017）01-83-5
2016-12-22审核人：翟所强）
10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.017
国家863青年科学家项目(2014AA020510)；国家973计划重大科学研究计划干细胞项目（2012CB967900)；中国科协创新驱动助力工程（2016CXQD01）
侯琨，在读硕士，研究方向:耳科学
侯琨和吴南为并列第一作者
杨仕明，Email:yangsm301@263.net
