高通量基因捕获测序技术在一遗传性耳聋大家系中的应用

孙菲菲 胡松群 张洁 吴笛 张启成 盛菊萍 张鲁平

南通大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（南通226001）

·临床研究·

高通量基因捕获测序技术在一遗传性耳聋大家系中的应用

孙菲菲 胡松群 张洁 吴笛 张启成 盛菊萍 张鲁平

南通大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科（南通226001）

目的分析一个常染色体显性遗传性非综合征耳聋大家系的临床特征，进行候选致病基因的突变筛查。方法对家系成员进行病史采集、全身检查、听力学评估及颞骨CT检查；抽提家系成员外周血基因组DNA；整理分析家系资料绘制系谱图；使用定向捕获联合二代测序技术,对包括所有已知非综合性耳聋的137个耳聋相关基因的外显子及其侧翼内含子序列进行筛查；对可疑基因进行Sanger测序验证。结果该家系共4代，现存家系成员28人，系谱分析符合常染色体显性遗传特征。参与本研究的耳聋患者9人，均为语后聋，均表现为迟发性、渐进性听力下降，发病年龄6～18岁，听力曲线多为平坦型。先证者（Ⅳ-4）检测结果经数据分析滤过后确定2个潜在基因致病突位点:MYH14,c.359C＞T,p.S120L;COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q。后续经直接测序验证,在该家系中，只有MYH14,c.359C＞T变异和家系的表型共分离，其余1个可疑突变位点在家系中无共分离现象。结论本研究鉴定了一个常染色体显性遗传性非综合征耳聋大家系的致病突变（MYH14,c.359C＞T），同时证实高通量基因捕获测序技术是遗传性耳聋的一种行之有效的分子诊断工具。

常染色体显性遗传；耳聋；家系；外显子捕获；基因突变

1 Nantong science and technology plan frontier and key technology innovation fund（MS22015048）；2；the postgraduate innovation program from Nantong University,YKC16110；3 National Science Foundation of China 81641155.

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

遗传性耳聋具有很高的遗传异质性，目前已成功定位超过170个非综合征耳聋基因位点，成功克隆的非综合征性耳聋基因超过80多个，常染色体隐性和显性遗传性非综合征耳聋的基因座位已经分别排序到DFNB103和DFNA67（http://hereditary⁃hearingloss.org）。在这样的背景下，采用传统方法对所收集的耳聋家系进行基因鉴定，往往既耗时又成本高。目标基因外显子捕获及测序（targeted next-generation sequencing）技术的快速发展，为解决上述棘手问题提供了契机[1-3]。本文利用高通量基因捕获测序技术，成功鉴定了一个常染色体显性遗传性非综合征耳聋大家系的突变基因，结果报道如下：

1 材料与方法

1.1家系资料的采集

本研究家系位于江苏省盐城市，命名为YC-1家系。先证者为24岁的女性，因听力下降伴耳鸣就诊于南通大学附属医院耳科门诊，纯音测听发现双耳轻度感音神经性耳聋。经询问家族史得知，患者父亲及直系家属中多人患有听力障碍。遂进一步对先证者及其父亲进行详细的病史采集和临床检查；并通过先证者父亲的帮助，获得家系其他成员的临床资料。家系成员在家系调查时，均通过详细的病史采集（一般情况、听力损失的起病年龄及诱因、进展情况、有无耳鸣、眩晕等伴随症状、耳毒性药物、既往有无系统性疾病及噪声接触史等）、体格检查（对所有的家系成员进行全身体检，特别关注毛发、皮肤、视力、眼底、虹膜的颜色、脊柱、外周神经的发育情况、智力、言语发育情况，排除综合症型遗传性耳聋）、听力学检查及相关特殊检查情况。为排除耳部器质性病变，对先证者及部分患者做了颞骨高分辨率CT扫描。家系成员均抽取外周静脉血6ml(采血管含EDTAK2抗凝剂)，提取基因组DNA备用。本研究得到受试者的知情同意及南通大学附属医院伦理委员会伦理论证认可。

1.2听力学检查及耳聋表型的分析

对纳入研究的家系成员进行如下检查①纯音测听检查，初步判断听力损失程度；②声导抗检查(包括鼓室导抗图、鼓室压力、声顺值、声反射)，了解中耳传导状况；③耳声发射检测耳蜗外毛细胞功能；④听觉诱发电位进行听性脑反应(ABR)阈值筛查，综合上述检查排除听神经病，本研究耳聋表型分析判断标准参照Van Camp等2003年提出的《非综合征型遗传性耳聋家系遗传及听力学描述术语建议案》，详见（http://hereditaryhearingloss.org）。应用Cyrillic 2.1软件，根据家系调查和听力结果绘制系谱图，对家系的遗传特征进行分析。

1.3候选致病基因突变筛查

通过北京迈基诺基因科技有限责任公司开发的耳聋芯片，定向捕获138个耳聋相关基因的外显子及其侧翼内含子序列，其中包括所有已知的非综合征耳聋基因。二代测序数据分析后得到的疑似致病基因突变位点，再通过常规Sanger测序方法，验证该位点在家系所有成员中与耳聋表型的共分离情况。待验证基因突变位点的扩增引物序列如下：COL11A2正反向引物：5＇-AGGACCGGT⁃GAAAAGGAAAA-3＇，5＇-CATCTTGGAGCCTG⁃GACCTA-3＇；MYH-14正反向引物：5＇-GAGCTTCAC⁃GGGTTCGAG-3＇，5＇-CAGTAGGTTCCGAGGCT⁃GTC-3＇。PCR的扩增的反应条件简述如下：95℃预变性10min后，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，3个循环；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，5个循环；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，10个循环；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，17个循环；反应结束后再72℃延伸5min，4℃保存。

2 结果

2.1家系表型特征

该家系居住于江苏省盐城市，共4代33人，现存家系成员3代28人，其中直系亲属19人，9人患病，系谱分析符合常染色体显性遗传特征（图1）。该家系确诊的9例感音神经性聋患者，年龄10～84岁，患者临床表现以迟发性听力下降为主，其他系统未见异常。家系成员中4人有耳鸣病史，均无前庭功能障碍。9例患者均无耳毒性药物接触史，无噪声接触史，均无智力障碍。对先证者（Ⅳ-4）和另外2位家系成员（Ⅱ-5，Ⅲ-3）行颞骨高分辨率CT扫描，未发现中耳、内耳结构异常及内听道的占位病变。该家系确诊的9例患者听力损失表现较为一致，均为语后聋，表现为迟发性、进行性、双侧对称性，发病年龄9～18岁，听力曲线多为平坦型。开始为轻度听力损失，听力损失程度随年龄而加

图1 YC-1家系系谱图Fig.1 Pedigree of family YC-1

图2 家系YC-1患病成员的听力-年龄对应图Fig.2 Audiograms of the family YC-1.Hearing thresholds were averages of both ears.All affected members exhibited symmetric audiometric confguration.

图3 MYH-14及COL11A2基因测序结果，箭头示突变位点Fig.3 Chromatograms of the mutant and wild-type sequences.Sanger sequencing results of the c.359C＞T mutation in the MYH14 gene and c.4478G＞Ain the COL1A2 gene.

2.2候选致病基因筛查结果

使用定向捕获联合二代测序技术，对先证者（Ⅳ-4）进行检测，经数据分析滤过后确定2个潜在致病突位点，结果为MYH-14,c.359C＞T,p.S120L; COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q。后续经直接测序验证（图3）,在该家系中，只有MYH14变异和家系的表型共分离，后者在家系中无共分离现象；同时，比较不同物种MYH14基因编码的蛋白质的差异以进行保守性分析，结果显示MYH14蛋白120位上的丝氨酸高度保守[2]。

3 讨论

2004年Donaudy F等[4]首次确认MYH14基因是DFNA4型耳聋的致病基因，MYH14位于19号染色体，属于3个编码非肌肉肌球蛋白重链的基因(MYH9，MYH10，MYH14)之一，在人和小鼠组织中广泛表达。在小鼠内耳中，Myh14在耳蜗的柯蒂氏器、血管纹和蜗管都有表达，前庭不表达，这也解释了该基因突变引起的耳聋都不伴周围性眩晕症状。

迄今发现MYH14基因7个突变位点（p.S7X、p. A181T、p.S120L、p.G376C、p.D529N、p.R726S和p. L976F）可以引起非综合征耳聋[4-8]，1个突变位点（p. R941L）与遗传性运动和感觉神经性疾病（HMSN，Hereditary motor and sensory neuropathy）有关[9]。本研究与Yang[5]等对一个德国耳聋家系的研究，以及国内杨嵘等[6]采集的耳聋大家系的研究结果一致，以上三个家系的致病突变都是MYH14基因（p. S120L突变），上述研究提示p.S120可能是MYH14的热点突变，该推测仍需今后研究进一步证实。该家系与国内的其他报道[6]，来自于同一地方（江苏盐城），提示在该地区的遗传性耳聋患者中，可以重点筛查MYH14（p.S120突变）。

既往研究发现的MYH14基因突变位点，几乎都是通过大遗传家系连锁定位分析候选基因筛查法发现的[4-6,9]。正如最近戴朴教授提出[2]，高通量测序的发展为遗传性耳聋的诊断带来了巨大的机遇，此项技术使同时筛查所有耳聋相关基因变得简便可行。本研究采取该技术，主要基于如下原因：①尽管连锁分析仍是遗传学研究最有力的工具之一，但对于研究者而言，需要花费相当的人力物力，耗时长；②随着耳聋基因越来越多地被发现，所研究家系已知耳聋基因突变致病的几率越来越大，成功鉴定家系致病突变的可能性随之也大大增加；③该技术可以通过对家系中多个耳聋患者和正常听力成员的检测，观察有无共分离，提高确定致病性突变的效率。本研究即采取这种策略，对先证者（Ⅳ-4）进行检测，经数据分析滤过后确定2个潜在致 病 突 变 位 点:MYH14,c.359C＞T,p.S120L; COL11A2,c.4478G＞A,p.R1493Q；通过PCR扩增和Sanger测序验证先证者(Ⅳ-4)的二代测序结果无误；后续在该家系中经测序验证，只有变异（MYH14,p.S120L）和家系的表型共分离，突变位点（COL11A2,p.R1493Q）在家系中不共分离，从而排除了其致病可能；经保守分析，突变的氨基酸在不同物种间具有高度保守性[5]；从国内外的报道[5,6]该突变又得到不同人种耳聋家系的证实，以上都是p. S120L是一个致病性错义突变的有力证据，其确切的致病机制仍需要进一步的功能试验进行验证。需要指出的是当前高通量测序技术也存在一定的局限性，也有假阳性和假阴性的困扰，假阳性影响较小，可以通过Sanger测序验证排除；假阴性处理目前困难，主要是由于该技术本身的局限造成，如对于如较长片段插入或缺失突变的检测效能有限、不能检测内含子突变、少量基因编码区域(如极高GC含量区域)检测的遗漏等。庆幸的是，既往研究表明遗传性耳聋基因的致病突变绝大多数位于编码区域，突变又以点突变和小片段的插入或缺失常见，使用该策略，国内外已有多例成功案例报道[1,2]。

综上所述，我们采集到一个常染色体显性遗传非综合征型迟发性耳聋大家系，应用高通量基因捕获测序技术，成功鉴定了该耳聋大家系的致病基因突变；本研究结果还证实了该技术是临床聋病分子诊断行之有效的检测手段，该技术的临床推广应用为耳聋患者的精准诊疗打下坚实基础，可望为耳聋家庭带来福祉。

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A next-generation sequencing gene panel for molecular diagnosis in a large Chinese family with autosomal dominant hearing loss

Sun Feifei,Hu Songqun,Zhang Jie,Wu Di,Zhang Qicheng,Sheng Juping,Zhang Luping
Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,China Corresponding author:Zhang Luping Emial:zhanglp910@126.com

Objective To investigate the clinical features of a large Chinese family with progressive autosomal dominant hearing loss,and to search for candidate mutational genes.Methods Collections of detailed medical history, physical examinations,audiologic testing,and CT scan of the temporal bones were performed,and genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of the family members.The inheritance model of the family was evaluated.137 deafness genes of the proband were captured and sequenced by targeted next-generation sequencing(NGS),and the results were confirmed by Sanger sequencing．Results This family has 28 members in 4 generations,of whom 9 persons are affected.All affected family members exhibit late-onset,progressive non-syndromic sensorineural hearing loss.The ages of onset were between 6 and 18 year-old.Two heterozygous missenses(MYH14 mutation c.359C＞T and COL11A2 c.4478G＞A)were identified.Variants were further confirmed by Sanger sequencing.Only the MYH14 mutation was co-segregated with autosomal dominant hearing loss phenotype.Conclusions The heterozygous MYH14 mutation c.359C＞T is responsible for the autosomal dominant sensorineural hearing loss in this Chinese family,and this report confirms that targeted NGS technique is a feasible and more cost-effective tool to detect causative mutations in hereditary hearing loss.

Autosomal dominant inheritance；Hereditary hearing loss；Pedigree；Targeted exome sequencing；Gene mutation

R764.43

A

1672-2922（2017）01-57-4

2016-06-20审核人：袁永一）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.012

1南通市科技计划前沿与关键技术创新基金（MS22015048）；2南通大学研究生科研创新资助项目（YKC16110）；3国家自然科学基金项目（81641155）

孙菲菲，硕士研究生在读，研究方向:聋病的分子生物学

张鲁平，Email:zhanglp910@126.com