聚乙二醇修饰树枝状聚（胺-酯）与牛血清白蛋白结合作用的研究

宁春花，金圣，秦玉杰，钟超，张奎

（1.常熟理工学院化学与材料工程学院，江苏 常熟 215500；2.江苏省新型功能材料重点建设实验室，江苏 常熟 215500）

聚乙二醇修饰树枝状聚（胺-酯）与牛血清白蛋白结合作用的研究

宁春花1，2，金圣1，秦玉杰1，钟超1，张奎1

（1.常熟理工学院化学与材料工程学院，江苏 常熟 215500；2.江苏省新型功能材料重点建设实验室，江苏 常熟 215500）

以端基为8个伯氨基的树枝状化合物［PAE（NH2）8］和聚乙二醇-600（PEG-600）为原料合成了聚乙二醇修饰的树枝状聚（胺-酯）（PAE-PEG）.通过正交实验讨论了反应温度、反应时间及原料配比对产物产率的影响.用荧光光谱法研究了PAE-PEG与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用.实验结果表明，PAE-PEG的加入使BSA发生荧光猝灭，其猝灭机制属于静态猝灭，通过计算得到PAE-PEG与BSA作用的动态猝灭常数为18.55 L/mmol.通过同步荧光研究发现，PAE-PEG的存在会改变BSA的构象.此外还考察了体系的pH值和离子强度对PAE-PEG与BSA相互作用的影响，发现两者结合的主要作用机制是静电作用.研究了金属离子Cu2+、Fe3+对PAE-PEG与BSA之间相互作用的影响，发现金属离子的存在并不改变两者的结合位点数，BSA和PAE-PEG之间的结合位点数均近似为0.7.

PEG；树枝状聚（胺-酯）；牛血清白蛋白；荧光光谱

聚乙二醇（PEG）是一类无毒、生物相容、无刺激性、免疫原性低的水溶性聚合物.树枝状大分子是一类结构规整、单分散性、径向对称的纳米级大分子，其端基具有活性基团，可以通过修饰连接抗体或基因等生物活性分子.同时树枝状大分子本身具有稳定性，无免疫原性和高的生物活性剂转运效率，因此其已成为一种广泛、有效的药物载体［1-2］.PEG修饰树枝状大分子形成具有疏水性内核、亲水性壳的单分子胶束，可用于增加药物溶解度用于药物转运体系，同时也能克服其他物质修饰树枝状大分子所带来的溶血毒性和细胞毒性等缺点，将成为一种更有发展前途的药物载体［3-4］.因此，研究PEG修饰的树枝状大分子对人类健康更具有意义.

血清白蛋白是生命体血浆中最为丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源化合物结合，具有重要的存贮运输功能.在体内起着保持酸度，贮存和运载金属离子、氨基酸、药物等重要作用，是基础科学研究中最常用的药物靶蛋白之一.牛血清白蛋白（BSA）与许多小分子物质发生相互作用研究的报道很多，然而与大分子，特别是树枝状大分子的研究很少.

本文通过一步法以乙二胺和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯为原料合成端氨基树枝状聚（胺-酯），与传统方法相比，无需官能团的保护-解保护，简化了合成步骤.通过荧光光谱法研究其对牛血清白蛋白荧光猝灭作用，探讨此体系的猝灭机制及PAE-PEG存在对于BSA构象的变化.此外，还研究pH值和金属离子的存在对BSA与PAE-PEG之间相互作用的影响.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

端基为8个伯氨基的树枝状聚（胺-酯）（PAE（NH2）8），实验室自制［5］；聚氧乙烯（654）（PEO-A（654））：实验室自制［6］；PEG-600，AR，中国医药集团上海化学试剂公司；BSA，生化试剂，上海众华生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷，AR，上海化学试剂站分装厂；其余试剂均为AR.

1.2 PAE-PEG的合成

1.2.1 合成路线

以甲醇为溶剂，以PAE（NH2）8和PEG-600为原料进行加成反应，反应式如图1所示.

图1 PAE-PEG的合成路线

PAE（NH2）8：端基为8个伯氨基的树枝状聚（胺-酯）；PEO-A（654）：聚氧乙烯（654）

表1 正交设计因素水平表

1.2.2 合成方法

称取2.5 g PAE（NH2）8溶于50 mL甲醇，加入到带有搅拌装置的250 mL三口烧瓶中，在氮气保护下，缓慢滴入10 mL 0.2 mol/L的PEO-A（654）甲醇溶液，50℃反应72 h，减压蒸馏，产物用无水乙醚沉淀纯化，40℃真空干燥48 h，得淡黄色黏状液体PAE-PEG.表1为其正交设计因素水平表.

1.3 PAE-PEG与BSA的相互作用

1.3.1 PAE-PEG对BSA荧光的猝灭作用

将BSA溶解于含有100 mmol/L NaCl的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，配成浓度为5 μmol/L的溶液.取2.5 mL BSA溶液于1 cm比色皿中，然后分别向溶液中加入不同浓度的PAE-PEG溶液，以295 nm为激发波长，记录300～400 nm范围内加入PAE-PEG前后BSA的荧光发射光谱.

1.3.2 同步荧光考察PAE-PEG对BSA氨基酸残基微环境的影响

固定荧光发射与激发波长的差值（Δλ）分别为15，60 nm时，分别测定上述BSA溶液的同步荧光光谱.然后向BSA溶液中加入不同浓度的PAE-PEG溶液，在同样条件下测定其同步荧光光谱.

1.3.3 pH值和离子强度对PAE-PEG与BSA相互作用的影响

将BSA分别溶于不同pH值或含有不同浓度NaCl的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，配成5 μmol/L的溶液，测定其荧光发射光谱.

1.3.4 Cu2+和Fe3+对PAE-PEG与BSA相互作用的影响

在BSA溶液中加入一定体积的金属离子Cu2+或Fe3+溶液，使金属离子与BSA的摩尔比为1：1.然后再加入不同体积的10 μmol/L PAE-PEG溶液，在同样测定条件下测定BSA的荧光发射光谱.

2 结果与讨论

2.1 PAE-PEG正交实验数据分析

由表2可知，反应时间、反应温度及摩尔配比三因素对反应产物产率的影响顺序为：反应时间＞反应温度＞摩尔配比.由正交表可以确定PAEPEG反应最佳条件分别为221.所以，最佳反应条件为：n［PAE（NH2）8］：n［PEO-A（654）］=1：16，反应温度为50℃，反应时间为72 h，此条件下合成产物产率达到58.33%.

表2 PAE-PEG合成实验设计及数据分析

2.2 PAE-PEG的FTIR表征

产物的FTIR谱图见图2.曲线a中3454 cm-1处为O-H的特征峰；1720 cm-1处为C=O的特征峰；1640 cm-1处为C=C的特征峰；1069，953，864 cm-1处为C-OC的特征峰.结果表明，PEO-A（654）中具有羰基、双键和醚结构的特征.曲线b中3412 cm-1处为酰胺中-NH-的特征峰；1720 cm-1处为C=O的特征峰；1294 cm-1处为C-O-C的特征峰.对比曲线a和曲线b，可知PAE（NH2）8与PEO-A（654）发生了加成反应.

2.3 PAE-PEG对BSA的荧光猝灭机理

荧光猝灭是指荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的荧光强度下降的现象，引起荧光猝灭的物质称为荧光猝灭剂.BSA含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等芳香氨基酸残基而发射较强的内源荧光.以295 nm为激发波长得到的是色氨酸残基的荧光发射光谱，而PAE-PEG自身在此范围内无荧光，因此对实验结果并不产生干扰.

图3是不同浓度的PAE-PEG对BSA的荧光猝灭图.由图可知，随着PAE-PEG浓度的不断增大，BSA的荧光强度逐渐降低，而发射峰的位置峰形不变.这表明PAE-PEG对BSA有荧光猝灭作用.

图2 PAE-PEG的红外光谱图

图3 PAE-PEG对BSA的荧光猝灭图

Stern-Volmer方程式为F0/F=1+Ksv［Q］，式中F0和F分别为不存在和存在PAE-PEG情况下的荧光强度，Ksv为动态猝灭常数；［Q］为PAE-PEG的浓度.根据计算得出PAE-PEG与BSA作用的动态猝灭常数Ksv为18.55 L/mmol，远远大于各种猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭过程的猝灭常数0.2 L/mmol，由此推断BSA荧光猝灭过程不是PAE-PEG扩散时所引起的动态猝灭，而是形成了复合物引起的静态猝灭.

双代数方程为log［（F0-F）/F］=logKa+nlog［Q］，式中Ka为结合常数，n为结合位点数.以log［（F0-F）/F］）对log［Q］作图，可以求得PAE-PEG与BSA之间的Ka和n.图4是PAE-PEG对BSA荧光猝灭的双对数曲线图，根据图4求得PAE-PEG和BSA相互作用的结合常数为11.66 L/ mmol，结合位点数为0.70.

图4 PAE-PEG对BSA荧光猝灭双对数曲线图

2.4 PAE-PEG对BSA构象的影响

同步荧光能够提供生色团周围微环境极性变化的影响情况，可以根据氨基酸发射波长的改变考察PAE-PEG对蛋白质构象的影响［7］.当Δλ=15 nm时，所作出的同步荧光光谱是酪氨酸残基的光谱特性，当Δλ=60 nm时，所作出的同步荧光光谱是色氨酸残基的光谱特性.图5为Δλ=15和60 nm条件下，BSA、PAE-PEG体系中BSA的同步荧光光谱.由图5可以看出，随着PAE-PEG浓度的不断增加，BSA的荧光强度都降低，且酪氨酸残基（Δλ=15 nm）的最大发射波长发生蓝移（18 nm），色氨酸的最大发射波长发生轻微的红移（1 nm），PAE-PEG的加入使酪氨酸和色氨酸的微环境发生了变化，从而导致BSA的构象也发生了变化.

2.5 pH值和离子强度对PAE-PEG与BSA相互作用的影响

图5 PAE-PEG与BSA相互作用的同步荧光光谱

血浆中pH值的变化和微量金属离子会影响蛋白与配体的相互作用［8］.图6、7为pH值和离子强度对PAE-PEG与BSA相互作用的影响图.由图6可知，当pH值从6.2下降至7.4时，Ksv呈下降趋势；当pH值从7.4上升至8.6时，Ksv呈上升趋势.在整个6.2～8.6的pH值范围内，猝灭程度变化趋势没有明显规律.这是因为pH值在6.2～8.6时，PAEPEG中的亚氨基都质子化后带正电荷，而BSA中羧基都带负电荷，两者会产生静电作用.当pH值为7.4时，两者的相互作用最强，BSA内源荧光猝灭作用最强.同时，也能看出pH值的变化使BSA氨基酸残基微环境发生变化.

由图7可知，NaCl的浓度在100 mmol/L时，PAE-PEG与BSA相互作用的Ksv最大，但随着NaCl浓度的增大，Ksv逐渐减小，由此说明PAE-PEG与BSA是以静电作用相结合的.随着溶液中Na+和Cl-离子强度的增加，Na+可与PAE-PEG中的亚铵阳离子竞争结合BSA中的羧酸根离子，从而减弱了两者的相互作用.

2.6 Cu2+、Fe3+对PAE-PEG与BSA之间相互作用的影响

图8为PAE-PEG对BSA的荧光猝灭图.图8（a）和图8（b）分别为Cu2+和Fe3+存在时PAE-PEG对BSA荧光猝灭图.在金属离子的存在下，加入PAE-PEG后BSA内源荧光强度的变化可以考察金属离子对PAEPEG与BSA之间相互作用的影响.对比图1和图8（a）、8（b）可以看出，随着PAE-PEG浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，但峰位不变，表明无论有无金属离子，PAE-PEG均能够猝灭BSA的内源性荧光.

从表5可以看出，在Cu2+存在的情况下，PAE-PEG与BSA的结合常数比不存在Cu2+时仅降低了5.06%；在Fe3+存在的情况下，PAE-PEG与BSA的结合常数与不存在Fe3+时相差较多，降低了33.88%，说明Cu2+的存在几乎不影响PAE-PEG与BSA的结合，而Fe3+存在会稍微降低两者的结合能力.这可能是因为Fe3+的存在使BSA的构象发生了改变，也可能是Fe3+与PAE-PEG竞争结合BSA.而不管有无金属离子存在，PAE-PEG和BSA之间的结合位点数均近似为0.70，说明金属离子的存在并不改变两者的结合位点数.

图6 pH值对PAE-PEG与BSA相互作用的影响

图7 离子强度对PAE-PEG与BSA相互作用的影响

图8 PAE-PEG对BSA内源性荧光猝灭图

表5 金属离子条件下PAE-PEG和BSA相互作用的动态猝灭常数、结合常数和结合位点数

3 结论

（1）利用PEG-600修饰PAE（NH2）8得PAE-PEG，其最佳反应条件为：以甲醇为溶剂，n［PAE（NH2）8］：n［（PEO-A（654）］=1∶16，反应温度为50℃，反应时间为72 h，产物产率为58.33%.

（2）PAE-PEG与BSA之间发生了能量转移，主要通过静电作用方式与BSA结合，使其内源荧光发生猝灭.同步荧光结果也说明了PAE-PEG的加入使BSA的构象发生改变.

（3）在生理条件下，采用荧光光谱研究了Cu2+、Fe3+对PAE-PEG与BSA相互作用的影响，结果表明PAEPEG对BSA的猝灭是静态猝灭，金属离子的存在不改变两者的作用类型和结合位点数.

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On the Interaction between Dendritic Poly(amine-ester)Modified by Polyethylene Glycol and Bovine Serum Albumin

NING Chunhua1,2,JIN Sheng1,QIN Yujie1,ZHONG Chao1,ZHANG Kui1
(1.School of Chemistry and Material Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500; 2.Jiangsu Laboratory of Advanced Functional Materials,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Dendritic poly(amine-ester)modified by polyethylene glycol(PAE-PEG)was synthesized from a dendrimer with 8 primary amines as the terminal group[PAE(NH2)8]and polyethylene glycol-600(PEG-600).The effects of the reaction temperature,the reaction time and the ratio of reactants on the yield of products were investigated by an orthogonal experiment.The interaction between PAE-PEG and bovine serum albumin(BSA)was studied by fluorescence spectroscopy.It was found that the fluorescence intensity of BSA decreased after the addition of PAE-PEG and the quenching mechanism was suggested as static quenching.The dynamic extinction constant of PAE-PEG with BSA was calculated to be 18.55 L/mmol.At the same time,synchronous fluorescence was adopted to review the conformational changes of BSA influenced by PAE-PEG.The results indicated that PAE-PEG could change the conformation of BSA,and make the tryptophan residue become more hydrophobic.Furthermore,this paper also examined the influence of pH and ionic strength on the interactions,from which it was concluded that electrostatic interaction played major roles in the binding process.The effects of Cu2+and Fe3+on the interaction between PAE-PEG and BSA were studied,and the results showed that different metal ions had different effects on the interaction between PAE-PEG and BSA,and that metal ions did not change the binding sites of PAE-PEG and BSA,which was approximately 0.7.

PEG;poly(amine-ester);bovine serum albumin;fluorescence spectroscopy

TQ317

A

1008-2794（2017）02-0109-06

2015-09-12

江苏省大学生创新训练计划项目“PEG化树枝状聚（胺-酯）的合成及性能研究”（20141033336）

宁春花，副教授，硕士，研究方向：树枝状大分子的合成及应用，E-mail：chunhuaning@163.com.