固相萃取-HPLC法检测熟肉制品中合成色素

毕小玲，宋娟，庄晓洪，王艳

（成都市食品药品检验研究院，四川成都610045）

固相萃取-HPLC法检测熟肉制品中合成色素

毕小玲，宋娟，庄晓洪，王艳

（成都市食品药品检验研究院，四川成都610045）

建立固相萃取-高效液相色谱法同时测定熟肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄4种合成色素的方法。熟肉制品绞碎后加入乙醇+氨水（75+25）溶液，经涡旋分散、超声提取，固相萃取柱净化后，采用一台液相仪器、两根KromasilC18柱串联分离，以甲醇和5mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行洗脱，用二极管阵列检测检测器在254 nm波长下检测。该方法在10 ng～160 ng范围内线性关系良好（r≥0.999 8）；4种色素回收率为87.0%～95.5%，检出限为0.04mg/kg～0.05mg/kg，相对标准偏差为2.37%～6.76%。该方法能同时分析熟肉制品中4种合成色素，并能得到稳定准确的结果，节约检测时间。

固相萃取；高效液相色谱法；合成色素；熟肉

熟肉制品以其营养丰富、味道鲜美而深受人们喜爱，市面上销售的熟肉制品具有食用方便、味道鲜美及色泽诱人等特点，是广大消费者热衷的熟食制品。然而不法生产商为降低成本，采用质量相对较差的原料，通过添加柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄等合成着色剂制作出色泽诱人的产品，从而实现改善产品色泽、提高销量的目的[1-2]。

合成着色剂因其成本低、着色效果好，被生产商用于食品的制作过程。随着研究的不断深入，人们开始逐渐认识到人工合成着色剂大多是偶氮类型化合物，许多偶氮类型化合物在人体内可代谢生成有毒副作用的物质[3]。鉴于其不安全因素，国内外对合成着色剂的使用制定了严格的规定，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》也对合成着色剂的使用范围和用量做了规定，其中熟肉制品中不得使用柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄等合成着色剂[4]。

现行的食品检验标准未涵盖熟肉制品中这4种合成着色剂的检验[5-6]。熟肉制品基质复杂，合成着色剂着色力强，需用超声等强化提取方法进行提取，并进行净化方可进行下一步分析。文献中提取方法对与基质相结合的着色剂提取不能保证，且用聚酰胺粉和抽滤漏斗进行净化，步骤繁琐，对批量检测造成了一定困难[2，7-12]。该研究采用超声提取、全自动固相萃取净化相结合的方法，并用双柱同时进行检测，为高效液相色谱法检测熟肉制品中多组分着色剂提供了快速有效的方法。

1材料与方法

1.1材料与试剂

样品（卤猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉等熟肉制品）：市场抽检；标准物质：柠檬黄标准品溶液：中国计量科学研究院；苋菜红、胭脂红、日落黄标准品溶液：国家标准物质研究中心；甲醇（色谱纯）：德国Merck；甲醇、乙醇、乙酸铵、氨水、甲酸等均为分析纯；超纯水（电阻18.3 MΩ/cm2）；Cleanert PWAX固相萃取柱（500 mg，3 mL）：北京Agela公司。

1.2仪器与设备

Ultimate 3000双三元高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器和Chromeleon 7.0工作站）：美国热电公司；GX-274全自动固相萃取仪：法国Gilson公司；实验室常规仪器。

1.3方法

1.3.1色谱条件

色谱柱：Kromasil100-5C18（4.6mm×250mm）；柱温：35℃；流动相：甲醇（A）和5mmol/L乙酸铵（B）；梯度洗脱程序见表1和表2；进样体积：10μL；流速：1.0mL/min；检测波长254 nm。

表1 流动相洗脱梯度Table1 Gradientelution program

表2 流动相洗脱梯度Table2 Gradientelution program

1.3.2样品提取

称取2.00 g绞碎样品于50 mL离心管中，加入10mL提取溶剂（乙醇+氨水=75+25），涡旋分散1min，超声提取20min，室温10 000 r/min离心5min，倾出上清液，加入10mL提取溶剂重复提取1次，合并上清液并摇匀。取上清液10mL于鸡心瓶，于50℃浓缩至4 mL～5mL，于70℃恒温30 s，分别加入1mL硫酸溶液（浓硫酸∶水=1∶9，体积比，）和1mL钨酸钠溶液（100 g/L），摇匀，继续于70℃水浴恒温5min，取出放至室温，转移鸡心瓶内物质并用水定容至10mL，摇匀，10 000 r/min离心5min，转移上清液至50mL离心管并用氨水调pH=5.0，待净化。

1.3.3净化

分别用6 mL甲醇、6 mL水活化固相萃取柱；取8 mL待净化液以0.5mL/min速度过柱；依次用6mL 0.5%甲酸甲醇溶液、6mL水淋洗小柱；最后用6mL 25%氨水甲醇以0.5mL/min速度洗脱，洗脱液于50℃氮气吹干，加水超声溶解残渣并定容至1mL，10 000 r/ min离心10min，上清液待测。

2结果与分析

2.1目标检测物的选择

GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》对可用于熟肉制品中的色素做了明确规定，其中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄禁止在熟肉制品中使用[4]。但是，由于这4种色素在市面使用较多，着色后的食物颜色自然，能够刺激消费者的食欲，同时，熟肉制品本身的颜色多为红色或黄色，因此这4种色素易被生产商用来改善熟肉制品的感官，减少劣质产品的损失，以较低的成本获得好的销量。另外，在以往报道出的食品安全事故中，柠檬黄和日落黄在餐饮店熟肉制品中被检出。基于以上信息，选择了这4种着色剂进行研究。

2.2色谱条件的优化

2.2.1流动相的选择

所选合成色素偏极性，根据极性差别，4种物质在反相色谱分离条件下流出时间也不同，采用甲醇-乙酸铵溶液体系作为流动相进行梯度洗脱，可以使4种物质得到很好的分离，并得到较好的峰形。当乙酸铵浓度为0.02mol/L[2，5-6，8-10]，甲醇初始比例为5%时，最后出峰时间为15min；当乙酸铵浓度降为0.005mol/L，甲醇初始比例为5%时，最后出峰时间可缩短到13.2min，此时4种物质也可以实现基线分离，且峰形对称。目标峰全部流出后将甲醇比例增加到90%，在6min内可将色谱柱中的杂质冲出，然后切换到初始浓度进行平衡，整体分析时间为25min。

2.2.2 色谱仪器的选择

当使用Ultimate 3000液相色谱仪的双三元泵系统，串联两根相同型号的色谱柱进行分析，在4种目标物全部由柱1流出后，对色谱柱进行切换，使柱1的冲柱程序在后台运行，用柱2开始分析下一个样品。此时完成一个样品的分析时间为14min，在很大程度上提高分析效率。

2.2.3检测波长的选择

通过二极管阵列检测器对4种物质在190 nm至600 nm范围内进行扫描，结果显示，柠檬黄在196、259、427 nm处有最大吸收，苋菜红在217、521 nm有最大吸收，胭脂红在216、248、335、509 nm处有最大吸收，日落黄在236、315、482 nm处有最大吸收，综合扫描结果、国标方法，选择254 nm作为唯一检测波长，既减少波长设置数、又可实现较低的检测限。

最佳色谱条件下，对标准品和样品进行分析，结果如图1和图2。

图1 合成色素标准混合溶液分离色谱图Fig.1 Chromatogram for them ixed 4 synthetic pigmentsstandards

图2 样品色谱图Fig.2 Chromatogram for sam ple

2.3样品前处理条件的优化

2.3.1提取条件的选择

这4种色素极性较强，易溶于水，微溶于乙醇。用水作为提取溶剂较难得到与蛋白质结合的色素，并且将提取出较多水溶性杂质。因此比较了氨水乙醇水溶液（20+70+10）[6，9，13]、氨水乙醇溶液（25+75）[8]对熟肉制品中色素的提取效率。结果表明，氨水乙醇溶液（25+ 75）提取率相对高。标准及文献[6，11，13]中先用石油醚去除油脂，然后加提取溶剂提取，研究对其进行了比较，结果显示用与不用石油醚对提取结果影响较小。

将样品粉碎，加入提取溶剂，涡旋分散样品并超声提取10min，所得样品提取率高于不超声。匀浆提取与超声比较，提取效率接近，均为90%左右，因此选择超声提取，可简化提取步骤。

分别对样品提取2次与3次，每次加入提取溶剂10mL。提取次数为2次与提取3次结果接近，因此选择2次提取。

提取指标的回收率数据比较见表3。

表3 提取指标考察Table3 Research of extraction items

2.3.2净化条件的优化

标准及文献[5-6，15]方法采用聚酰胺粉吸附法进行净化，控制操作温度为60℃～70℃，用漏斗抽滤，经至少3次淋洗，需淋洗液和洗脱液体积大，过程繁琐。研究选用PWAX固相萃取柱净化，将待净化液用氨水调节pH=5.0，上样后用5%甲酸甲醇溶液、水依次淋洗，然后用25%氨水甲醇洗脱，氮气吹干，用水定容即可。极大地简化了操作步骤，同时能进行批处理，提高了检验效率。

2.3.3针头过滤器的选择[11]

研究显示，尼龙膜和聚醚砜膜对苋菜红和胭脂红均有吸附，为了避免损失，检验过程采用高速离心代替过滤。经试验，未经过膜的样品并未显著影响色谱柱的使用寿命。因此，选择高速离心后直接上机测试。

2.4分析方法特性

2.4.1标准曲线和检出限

分别吸取4种标准物质适量，用水稀释成质量浓度为100mg/L的混合标准储备液，再用水将储备液稀释成质量浓度为1、2、4、8、16mg/L的标准系列，分别取10μL注入液相色谱仪测定，得标准曲线和方法检出限，各着色剂峰面积与浓度的线性关系方程、相关系数、及检出限如表4所示。

2.4.2加标回收和精密度

平行称取9份阴性粉碎样品于50mL离心管，分为3组，分别加入相当于4、10、20μg色素含量的混合标准品溶液，涡旋分散，并放置30min。按照样品提取与净化方法对9个样品进行处理，测定，计算回收率和精密度，结果见表5和图3。

表4 色素各组分标准曲线方程、线性范围、相关系数及检出限Table4 Calibration equations，linerity range，correlation coefficientsand detection lim its for the4 synthetic pigments

表5 加标回收率（n=3）Table5 Recovery and RSD for the4 synthetic pigmentsin spiked sample（n=3）

图3 样品加标色谱图Fig.3 Chrom atogram for spiked sam ple

3结论

通过对熟肉制品中合成着色剂的提取、净化、色谱分析，建立了适用于检验熟肉制品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄含量的方法。方法中超声提取、批处理净化、流动相优化、双柱同时分析等步骤，确保提取效果的同时，缩短了分析时间，检出限优于标准方法GB/T5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》，且方法重现性、精密度、稳定性良好。试验表明，该方法适用于熟肉制品中合成着色剂的检验。

采用此检测方法共检出抽检熟肉制品中滥用合成色素23批次，其中柠檬黄18批次，添加范围0.000 59 g/kg～0.014 g/kg；胭脂红3批次，添加范围0.000 76 g/kg～0.005 2 g/kg；柠檬黄2批次，添加范围0.010 g/kg～0.015 g/kg。

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Determ ination of Synthetic Pigments in Cooked M eat by Solid Phase Extraction and HPLC

BIXiao-ling，SONG Juan，ZHUANGXiao-hong，WANGYan
（Chengdu Center for Food and DrugControl，Chengdu 610045，Sichuan，China）

Amethod ofsolid phase extraction（SPE）and high performance liquid chromatography（HPLC）for determining synthetic pigments in cooked meatwas developed.It included lemon yellow，amaranth，carmine and sunsetyellow.Cookedmeatwasminced.By adding ethanol-ammonium hydroxide solvent（75±25），eddying，supersonic extracting and SPE purifying，the synthetic pigments was extracted.Then the 4 components could beeluted and seperated in KromasilC18 column bymobile phasemadeup ofmethanoland 5mmol/Lammonium acetate.Theywere detected in 254 nm by diode array detector.There could be 2 same columns paralled forsimultaneousanalysis.Themethod exhibited excellent linearity overa rangeof10 ng-160 ng（r≥0.999 8）. The recovery rate，detection limit，and relative standard deviation（RSD）were 87.0%-95.5%，0.04mg/kg-0.05mg/kg，2.37%-6.76%.Themethod can providessimultaneously steady and accurate results for the 4 synthetic pigments in cookedmeat，and save the detection time.

solid phase extraction（SPE）；high performance liquid chromatography（HPLC）；synthetic pigment；cookedmeat

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.038

2016-05-03

毕小玲（1982—），女（汉），工程师，硕士，从事食品理化检验工作。