基于黑木耳菌Aas1502液态深层发酵培养基组成的优化

刘俊梅，丁伟，王庆，杨盼盼，王玉华，朴春红，于寒松，李琢伟

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.长春职业技术学院，吉林长春130033）

基于黑木耳菌Aas1502液态深层发酵培养基组成的优化

刘俊梅1，丁伟1，王庆1，杨盼盼1，王玉华1，朴春红1，于寒松1，李琢伟2，*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.长春职业技术学院，吉林长春130033）

以胞外多糖产量和菌丝体干重为检测指标，优化黑木耳菌Aas1502胞外多糖液态深层发酵培养基组成。通过单因素试验，确定培养基碳源和氮源种类及培养基中碳源、氮源、KH2PO4和MgSO4·7H2O的浓度。利用正交试验进一步优化，并通过方差分析最终确定优化培养基组成为：马铃薯淀粉20 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，此时胞外多糖产量和菌丝体干重，分别为9.36 g/L和12.27 g/L，胞外多糖比优化前提高了1.48倍，为后续利用深层发酵提取黑木耳多糖提供了理论基础。

液态深层发酵；正交优化；胞外多糖

黑木耳菌（Auricularia Auricular strain，Aas）是一种药食同源真菌[1]，目前采用该菌作为固体栽培出发菌株，其黑木耳子实体中活性物质多糖含量最为丰富。但采用固体栽培获得黑木耳子实体存在生产周期长、产量低、受季节等条件限制的问题[2-4]，黑木耳多糖的产量较低，而采用深层发酵技术可以有效避免上述条件的限制，还可以避免提取多糖过程中胞内多糖不易溶出的问题[5]，进而提高黑木耳多糖的产量。黑木耳多糖（Auriculariaauricular polysaccharide），是一种具有生物活性的次级代谢产物[6]，在食品领域常作为增稠剂、稳定剂、粘合剂[7]；在医药、保健品领域常起到抗炎[8]、抗氧化[9]和提高免疫[10]等作用。近年来，黑木耳多糖日益受到人们的重视[11]，国内外对黑木耳多糖的报道也数见不鲜。本文采用液态深层发酵技术，通过正交试验优化发酵培养基组成，进一步提高黑木耳多糖的产量。为进一步利用液态深层发酵技术生产黑木耳多糖提供理论参考。

1材料与方法

1.1菌种与试剂

菌种来源：黑木耳菌种（AuriculariaAuriculastrain）Aas1502购买于吉林省吉蕈食用菌研究所。

标准葡萄糖、重苯酚、硫酸、磷酸二氢钾（KH2PO4）、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）均为分析纯试剂。

1.2主要培养基

斜面培养基：200 g马铃薯切片，沸水煮汁30min，定容至1 L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂粉20 g/L。

种子培养基：200 g马铃薯切片，沸水煮汁30min，葡萄糖20 g/L，蛋白胨3 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，蒸馏水定容至1 L。

碳源试验发酵培养基：葡萄糖20 g/L，马铃薯淀粉20 g/L（葡萄糖、蔗糖、果糖、玉米淀粉），蛋白胨4 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，VB0.05 g/L，蒸馏水定容至1 L。

氮源试验发酵培养基：葡萄糖20 g/L，马铃薯淀粉20 g/L，蛋白胨3 g/L（豆粕粉、鱼粉、酵母浸粉、牛肉膏），KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB0.05 g/L，蒸馏水定容至1 L。

无机盐试验培养基：采用优化好的碳氮源，分别加入不同比例的KH2PO4（MgSO4·7H2O），蒸馏水定容至1 L进行试验。

1.4仪器与设备

MCV-131BNF（T）超净工作台：SANYO Electric Co.，Ltd.；DHP120恒温培养箱：上海实验仪器厂有限公司；YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；CHA-S恒温振荡器：国华企业；3K15高速冷冻离心机：美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1培养基配制与操作

1.2.1.1种子活化

在无菌条件下，切取新鲜斜面种子菌丝块约0.5 cm2，接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、150 r/min的恒温箱摇床中培养5 d。

1.2.1.2发酵培养

在无菌条件下，将液体种子按照液体发酵培养基10%的比例，接种于装有100mL培养基的250mL三角瓶中。在30℃、150 r/min环境下的恒温培养5 d。

1.2.2胞外多糖提取

发酵体系9 500 r/min离心15min，将菌丝体与发酵液分离，菌丝体用蒸馏水洗涤3次，冻干，保存。发酵液加入3倍体积95%乙醇，4℃过夜，冻干，获得样品即为胞外粗多糖。

1.2.3淀粉检测

发酵上清液，用碘溶液检验淀粉是否完全水解。

1.2.4胞外粗多糖称重

胞外粗多糖在-55℃条件下，冷冻干燥，称重。

1.2.5菌丝体干重的测定

照明设计逐渐成为展示空间氛围营造的重要元素，它不仅可以界定展示空间、照明展示环境，还能创造出不同的文化内涵和空间格调。展示空间的照明设计师一个系统工程问题，具有很强的工艺要求，要合理选择光源、灯具和布局形式，以营造出赋有生命、充满活力、感觉逼真、整体优化的展示环境，从而提高展示空间效果。

用3倍体积蒸馏水将菌丝体洗涤3次，在9500 r/min条件下，离心10min，冷冻干燥至恒重，称重，即为菌丝体干重。

1.2.6正交试验分析

分别以胞外多糖的产量（Aw yield），菌丝体干重（Dry weightofmycelium，MDW），胞外多糖产量占菌丝体干重的百分比（Aw content）为考察依据，对碳源种类、氮源种类、碳源浓度、氮源浓度、KH2PO4浓度、MgSO4·7H2O浓度进行单因素试验，单因素结果采用origin8.0进行图表分析；然后，以单因素试验结果为基础，利用spss软件对正交试验数据进行方差分析和差异显著性分析。

经过对碳源种类、氮源种类、碳源浓度、氮源浓度、K2HPO4浓度、MgSO4·7H2O浓度单因素试验，获得四因素三水平正交试验因素水平表，见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Table1 L9（34）Orthogonalexperiment factor levels

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1碳源种类对胞外多糖的影响

以胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比为检测指标，考察葡萄糖、蔗糖、果糖、马铃薯淀粉、玉米淀粉5种碳源对各指标的影响，结果如图1所示。

图1 碳源种类对生产胞外多糖的影响Fig.1 Effectof carbon sourceon exopolysaccharidep roduction

从图1中可以看出，以上5种碳源对胞外多糖产量有很大影响；蔗糖与果糖不利于该菌种的生长且胞外多糖的产量较低；玉米淀粉有利于该菌种的生长，不利于胞外多糖的合成。胞外多糖产量分析得出，不同碳源发酵培养结果之间存在差异显著性（P＜0.05）。考虑到马铃薯淀粉价格低廉、来源丰富，重复性试验验证该菌种对马铃薯淀粉的利用最好，确定为最佳碳源。

以胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占细胞干重百分比为检测指标，考察蛋白胨、豆粕粉、鱼粉、酵母浸粉、牛肉膏5种氮源对各指标的影响，结果如图2所示。

图2 氮源种类对生产胞外多糖的影响Fig.2 Effectof Nitrogen sourceon exopolysaccharideproduction

从图2中可以看出，以上5种氮源对胞外多糖的产量有一定影响；蛋白胨有利于该菌种的生长，Aw的产量明显高于其他组；牛肉膏不利于该菌种生长，胞外多糖产量很低。胞外多糖产量分析得出，发酵培养基氮源中蛋白胨分别与酵母浸粉、牛肉膏组有显著性差异（P＜0.05）。通过重复性试验，考察3个指标证明该菌种对蛋白胨的利用最好，确定为最佳氮源。

2.1.3碳源浓度对胞外多糖的影响

通过碳源种类优化，确定最佳碳源为马铃薯淀粉，其中，总碳源中含有20 g/L的葡萄糖；通过考察胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比3个指标，探究不同碳源浓度对生产胞外多糖影响，结果见图3。

图3 碳源浓度对生产胞外多糖的影响Fig.3 Effectof carbon source concentration on exopolysaccharide production

从图3得出，随着碳源浓度的上升，各指标呈现先上升后下降趋势，胞外多糖产量和菌丝体干重曲线趋势相似。碳源浓度在30 g/L～40 g/L之间时，胞外多糖产量和菌丝体干重呈现明显上升趋势；碳源浓度为40 g/L时，3个指标分别达到6.23 g/L、11.21g/L、56.08%；马铃薯淀粉浓度为10、20、30 g/L时，Aw的产量和MDW均具有显著性差异（P＜0.05）。因此，选择10、20、30g/L作为后续正交试验马铃薯淀粉浓度的3个水平。

2.1.4氮源浓度对胞外多糖的影响

通过氮源种类优化，确定最佳碳源为蛋白胨；利用胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比3个指标，考察不同浓度蛋白胨对生产胞外多糖的影响，结果如图4所示。

从图4得出，各指标随着蛋白胨浓度的增加呈现先上升后下降趋势。蛋白胨浓度在2 g/L～4 g/L之间时，胞外多糖产量、菌丝体干重急剧上升；蛋白胨浓度为4 g/L时，菌丝体干重、胞外多糖占细胞干重百分比分别达11.95g/L、49.95%；蛋白胨浓度在4 g/L～10 g/L之间时，不利于胞外多糖的产生和菌体生长。蛋白胨浓度为2、4、6 g/L时，Aw的产量和MDW均具有显著性差异（P＜0.05）。因此，选择2、4、6 g/L作为后续正交试验蛋白胨浓度的3个水平。

2.1.5 KH2PO4浓度对胞外多糖的影响

图4 氮源浓度对生产胞外多糖的影响Fig.4 Effectof nitrogen source concentration on exopolysaccharide production

以胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比为检测指标，考察不同KH2PO4浓度对生产胞外多糖的影响，结果如图5所示。

图5 KH2PO4浓度对生产胞外多糖的影响Fig.5 Effectof KH2PO4concentration on exopolysaccharide production

从图5中可以看出，各检测指标随着KH2PO4的增加呈现线性增长，又缓慢下降的变化趋势，当KH2PO4为1.0 g/L时，胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比均达到最大值，分别为7.06 g/L、11.98 g/L、58.93%。当KH2PO4在0～1.0 g/L时，随着KH2PO4浓度的不断增加，胞外多糖产量和菌体呈线性生长；当KH2PO4浓度超过1.0 g/L时，3个指标开始缓慢下降，KH2PO4浓度为0.5、1.0、1.5 g/L时，Aw的产量和MDW均具有显著性差异（P＜0.05）。综上所述，选择0.5、1.0、1.5 g/L浓度KH2PO4作为正交试验3个水平。

2.1.6 MgSO4·7H2O浓度对胞外多糖的影响

以胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重百分比为检测指标，考察不同MgSO4·7H2O浓度对生产胞外多糖的影响，结果如图6所示。

图6 M gSO4·7H2O浓度对生产胞外多糖的影响Fig.6 EffectofM gSO4·7H2O concentration on Aw production

从图6中可以看出，胞外多糖产量与菌丝体干重整体变化趋势不大，胞外多糖占菌丝体干重百分比明显增加。当MgSO4浓度小于0.4 g/L时，胞外多糖占菌丝体干重百分比急剧上升；当MgSO4浓度在0.2 g/L～0.4 g/L之间时，胞外多糖产量缓慢上升，最大值为7.23 g/L；当MgSO4浓度大于0.4 g/L时，Aw产量和菌丝体干重缓慢下降并趋于平稳。综上，当MgSO4·7H2O浓度达到0.2 g/L以上后，对MDW无显著影响，对胞外多糖的积累有一定影响，胞外多糖产量为主要检测指标，确定MgSO4·7H2O 3个水平浓度为0.2、0.4、0.6 g/L。

2.2正交试验结果

根据正交试验因素水平表（表1），进行试验，得出正交试验结果，如表2。

表2 培养基组成优化正交试验表Table2 Theorthogonal test tableofm edium optim ization

续表2培养基组成优化正交试验表Continue table2 Theorthogonal test tableofmedium optim ization

通过直观分析表2可以得出，4个因素对每个指标有明显影响且对各指标的影响趋势相似。4个因素中，马铃薯淀粉浓度是影响3个指标的主要因素，最终得出影响试验结果的主次顺序为：马铃薯淀粉浓度＞蛋白胨浓度＞KH2PO4浓度＞MgSO4·7H2O浓度。胞外多糖产量为结果主要指标，通过k值得出最佳培养基组成为A2B2C2D1，即马铃薯淀粉20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L。而表2中第5组试验A2B2C3D1胞外多糖产量最高，但与之培养基组成含量不同，因此需要验证试验。

2.3验证试验

为了进一步验证结果的可靠性与稳定性，将得到A2B2C2D1的培养基组成与表2第5组试验进行对比，结果经分析，由A2B2C2D1组成的培养体系中胞外多糖平均产量为（9.121±0.21）g/L，第5组试验的胞外多糖平均产量为（9.355±0.25）g/L，该结果表明，第五组试验培养基组成能有效提高胞外多糖产量，且可靠性与稳定性较好。

2.4方差结果分析

胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重正交试验方差分析结果见表3。

表3 胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重正交试验方差分析结果Tab le3 Theanalysisofvarianceof theorthogonalexperim entalof Aw yield，MDW and Aw content

从表3可知，马铃薯淀粉浓度是影响胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重的极显著因素（P＜0.01），马铃薯淀粉的添加量，在整个发酵过程中起主导作用；蛋白胨浓度是影响胞外多糖产量、菌丝体干重的显著性因素（P＜0.05），可以使胞外多糖占菌丝体干重比例维持在一定水平；K2HPO4浓度是影响菌丝体干重的显著性因素，有利于胞内多糖的提取。

3讨论

国内外研究表明，深层发酵与碳源存在很大关系，碳作为构成细胞物质的主要来源，也是菌丝体生长的主要能量来源，单糖作为单一碳源，虽然可以直接利用，但在培养基中代谢过快，容易产酸，影响培养基的pH值，可能抑制菌丝体生长[12]。因此本研究重点考察葡萄糖与其他碳源组合对胞外多糖产量的影响。结果证明，碳源是影响本试验多糖产量的极显著因素。黑木耳菌为偏好碳源性真菌，氮源在培养基中比例较小。无机盐因子是培养基组成的关键因素，研究表明，磷酸盐对于黑木耳深层发酵过程非常重要，硫酸镁对黑木耳发酵产胞外多糖有良好的促进作用[13]。

4结论

通过对以上试验结果综合分析，筛选出深层发酵黑木耳菌Aas1502最佳培养基组成为A2B2C3D1，即马铃薯淀粉20 g/L、蛋白胨4 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4· 7H2O 0.2 g/L。利用此培养基深层发酵黑木耳菌Aas1502，胞外多糖产量、菌丝体干重、胞外多糖占菌丝体干重比例分别可达9.36 g/L、12.27 g/L、76.28%，胞外多糖产量是优化前的1.48倍。

[1]Yang L,Zhao T,Wei H,et al.Carboxymethylation of polysaccharides from Auricularia auricula and their antioxidant activities in vitro[J].International journalofbiologicalmacromolecules,2011,49 (5):1124-1130

[2]隋进清,徐立.袋栽黑木耳秋季栽培技术[J].中国食用菌,2012,31 (6):68-69

[3]田雪梅,宋爱荣.用正交试验法筛选樟芝菌适宜发酵培养基[J].菌物研究,2005,2(3):33-38

[4]肖彩霞.黑木耳液体深层发酵的研究[D].无锡:江南大学,2004

[5]娄在祥,张有林,王洪新.超声波协同酶法提取黑木耳多糖[J].食品工业,2007,28(1):29-32

[6]Giavasis I.Bioactive fungal polysaccharides as potential functional ingredients in food and nutraceuticals[J].CurrentOpinion inBiotechnology,2014,26:162-173[7]Bao H,You SG,Cao L,etal.Chemicaland rheologicalpropertiesof polysaccharides from fruit body of Auricularia auricular-judae[J]. Food Hydrocolloids,2016,57:30-37

[8]张文婷.黑木耳多糖药理活性研究[D].长春:吉林农业大学,2012

[9]韩晓倩.径向色谱技术分离黑木耳抗氧化活性多糖的研究[D].杭州:浙江工商大学,2010

[10]Nguyen T L,Wang D,Hu Y,et al.Immuno-enhancing activity of sulfated Auriculariaauriculapolysaccharides[J].Carbohydratepolymers,2012,89(4):1117-1122

[11]毛勇.深层发酵双孢菇胞外多糖的研究[D].无锡:江南大学,2013

[12]杨孝丽,刘美月,吴晓蕾,等.深层发酵液优化提高灰树花中多糖产量的研究[J].食品研究与开发,2015,36(24):51-55

[13]MAHAPATRA S,BANERJEE D.Fungal exopolysaccharide:production,compositionandapplications[J].Microbiology Insights,2013, 6(1):1-16

[14]Wu J,Ding ZY,Zhang K C.Improvementofexopolysaccharide production bymacro-fungus Auricularia auricula in submerged culture [J].Enzymeand Microbial Technology,2006,39(4):743-749

M edium Optim ization for Extracellular Polysaccharide Production of Auricularia Auricula strain 1502 by Subm erged Fermentation

LIU Jun-mei1，DINGWei1，WANGQing1，YANGPan-pan1，WANGYu-hua1，PIAOChun-hong1，YUHan-song1，LIZhuo-wei2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin AgriculturalUniversity，Changchun 130118，Jilin，China；2.Changchun Vocational Instituteof Technology，Changchun 130033，Jilin，China）

The composition of submerged fermentationmedium for extracellular polysaccharides from Auricularia Auricula strain 1502wasoptimized in thisstudy.Production ofextracellular polysaccharide andmycelium dryweightwere regarded as research index to determine the composition of themedium.Carbon sources，nitrogen sources，carbon concentration，nitrogen concentration，KH2PO4concentration and MgSO4·7H2O concentrationwere determined by single-factor test.Orthogonal testwasused to analysis the variance of the two indexes，the optimal composition of culturemedium were determined：potato starch 20 g/L，glucose 20 g/L，peptone 4 g/L，KH2PO41.5 g/L and MgSO4·7H2O 0.2 g/L.Production ofextracellular polysaccharide andmycelium dry weightwere 9.36 g/L and 12.27g/L，respectively.The effectwas significant that the production of extracellular polysaccharide was 1.48 times as before.A theoretical basis was provided for the subsequent extraction of polysaccharides from Auricularia Auriculastrain using submerged fermentation by this result.

submerged fermentation；orthogonaloptimization；extracellularpolysaccharide

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.042

2016-05-25

吉林省重大科技攻关项目（20140203019NY）

刘俊梅（1973—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物化学与功能性食品。

*通信作者：李琢伟（1974—），男，副教授，硕士，研究方向：食药菌加工与生产。