响应面法优化朵贝茶抗氧化活性的冲泡工艺

郭建军，周艺，孙海燕，王婉莹，许利嘉

（1.安顺学院农学院，贵州安顺561000；2.贵州大学药学院，贵州贵阳550000；3.中国科学院深圳先进技术研究院，深圳518055；4.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193）

响应面法优化朵贝茶抗氧化活性的冲泡工艺

郭建军1，周艺2，孙海燕3，王婉莹4，许利嘉4

（1.安顺学院农学院，贵州安顺561000；2.贵州大学药学院，贵州贵阳550000；3.中国科学院深圳先进技术研究院，深圳518055；4.中国医学科学院药用植物研究所，北京100193）

以安顺朵贝茶为原料，采用DPPH自由基清除率为评价指标，对冲泡温度、冲泡次数、冲泡时间、料液比、水质和冲泡方法进行研究，采用响应曲面分析法优化朵贝茶的冲泡工艺。结果表明，朵贝茶的料液比为1∶48（g/mL），单次冲泡时间为3.8min，冲泡温度为80℃时，茶汤的DPPH自由基清除活性最高。

朵贝茶；抗氧化；冲泡工艺；响应面

自1956年自由基衰老学说创立以来[1]，针对自由基的生命科学研究日益深入，许多疾病如神经疾病、癌症、免疫紊乱、心血管疾病及内脏器官的损伤或老化，都与自由基导致的细胞损伤有关[2]。因此，抗氧化剂的开发已成为人们关注的热点。

茶叶是山茶科植物，具有良好的抗氧化活性。化学研究表明茶叶中富含茶多酚、茶多糖、茶氨酸等活性成分，药理研究显示茶叶具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、改善心血管疾病和抗衰老等多种功效[3-4]。茶多酚作为茶叶中的主要活性物质，可减轻机体氧化水平，增加抗氧化物酶的活力，其抗氧化活性远优于VC[5-7]。此外，茶叶中的茶多糖、微量元素和维生素类也可增加茶叶的抗氧化活性[8-9]。

朵贝茶（DuobeiTea）是贵州的历史名茶，产于安顺市普定县化处镇境内1300米的高山上，自明初洪武年间便作为贡品供奉皇室[10]。贵州省茶叶科学研究所研究结果表明，朵贝茶富含茶多酚、黄酮、氨基酸等多种化学物质。但朵贝茶的抗氧化活性和冲泡工艺研究未见报道。本试验以朵贝茶为原料，通过单因素和响应面法研究其最佳冲泡条件，采用DPPH法评价茶叶的抗氧化活性，为科学指导朵贝茶的开发利用提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

朵贝茶：一芽一叶，2015年3月产，贵州普定；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：美国Sigma-Aldrich公司；XPE-205型电子分析天平：美国METTLER TOLEDO；MQX200R2全波长酶标仪：美国Bio Tek。

1.2试验方法

1.2.1清除DPPH自由基能力的测定

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）分子结构中的苯环大π键以及多个-NO2吸电子基团，使夹在中间的氮自由基能稳定存在，这种稳定的DPPH自由基被清除的能力，为评价抗氧化活性提供了一个简单、可靠的方法。目前在评价生物样品、食品以及植物提取物等的体外抗氧化活性方面得到了广泛的应用。根据MiliauskasG[11]等的DPPH分析法，本文对DPPH自由基清除试验进行了改进。取朵贝茶茶汤和DPPH无水乙醇溶液（2×10-4mol/L）各2mL混合，进行30min暗室反应。在517 nm最大波长处，用无水乙醇调零，测吸光度A0；DPPH醇溶液混合液和无水乙醇各2mL，测吸光度A2；无水乙醇混合液和样液各2mL，测吸光度A1。

计算公式为：DPPH清除率/%=[1－（A0－A1）/A2]×100

样品DPPH自由基清除率为重复3次测定后的均值。在一定范围内可以用清除率的大小来表示样品液抗氧化活性的能力[12]。

1.2.2单因素试验

以朵贝茶为样品，以日常冲泡条件为基础，设置不同的冲泡温度、料液比、冲泡时间、冲泡次数、冲泡水质、冲泡器皿等试验条件，采用DPPH自由基法考察不同试验因素对朵贝茶茶汤抗氧化活性的影响。

1.2.2.1冲泡温度

称取1.0g的朵贝茶，加入50mL纯净水，按冲泡次数为1次，冲泡时间为4min，考察不同冲泡时间对朵贝茶抗氧化活性的影响。设置冲泡温度为60、70、80、90、100℃，采用DPPH自由基清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.2.2料液比

称取1.0g的朵贝茶，加入纯净水，按冲泡次数为1次，冲泡时间为4min，冲泡温度为80℃，考察不同料液比对朵贝茶抗氧化活性的影响。设置冲泡料液比为1∶40、1∶50、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL），采用DPPH自由基清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.2.3冲泡时间

称取1.0 g的朵贝茶，加入50mL的纯净水，按冲泡次数为1次，冲泡温度为80℃，考察不同冲泡时间对朵贝茶抗氧化活性的影响。设置冲泡时间为2、4、6、8、10min，采用DPPH自由基清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.2.4冲泡次数

称取1.0 g的朵贝茶，加入50mL的纯净水，按冲泡时间为4min，冲泡温度为80℃，考察不同冲泡次数对朵贝茶抗氧化活性的影响。设置冲泡次数为1、2、3、4、5、6次，采用DPPH清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.2.5水质

称取1.0 g的朵贝茶，加入50mL的水，按冲泡次数为1次，冲泡温度为80℃，冲泡时间为4min，考察不同冲泡水质对朵贝茶抗氧化活性的影响。设置冲泡水为自来水、娃哈哈矿泉水、纯净水和超纯水，采用DPPH自由基清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.2.6其它冲泡因素

称取1.0 g的朵贝特级茶，下投法放入玻璃杯中，加入50mL、80℃的纯净水冲泡1次，冲泡时间为4min，考察不同冲泡方法对朵贝茶抗氧化活性的影响。分别设置冲泡方法为盖瓷杯、上投法及朵贝普通级茶，采用DPPH自由基清除率检测朵贝茶茶汤的抗氧化活性。

1.2.3响应面分析试验

采用Design Expert8.0，根据中心组合设计原理，基于单因素不变的条件下，选取朵贝茶的A冲泡时间（min）、B冲泡温度（℃）和C料液比（g/mL）为自变量，响应值为朵贝茶茶汤的DPPH自由基清除率（%）。应用响应面分析方法优化朵贝茶抗氧化活性的冲泡工艺，响应面分析试验设计见表1。

表1 响应面试验设计表Tab le1 Factorsand levelsof responsesurfaceexperim ents

2结果与分析

2.1朵贝茶抗氧化活性单因素试验

2.1.1冲泡温度

温度对DPPH自由基清除率的影响见图1。

图1 温度对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effectof temperatureon theDPPH inhibition

如图1，朵贝茶茶汤DPPH自由基清除率随温度的升高而先增加后减少，80℃时达到最高值。分析原因可能是当冲泡温度为60℃时，较低的冲泡温度影响了朵贝茶中有效成分的溶解，导致清除率较低；过高的冲泡温度，使朵贝茶的熟化速度加快，窒塞了有效成分的溶解，导致茶汤清除率受影响；当水温达到100℃时，可能是加快了朵贝茶中有效成分的溶解，导致茶汤自由基清除率增大。而冲泡温度过高，易导致有效成分发生变化。因此，选择冲泡温度70、80、90℃进行响应面试验。

2.1.2料液比

料液比对DPPH自由基清除率的影响见图2。

图2 料液比对DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effectof solid-liquid ratio on the DPPH inhibition

如图2，朵贝茶茶汤DPPH自由基清除率随料液比的升高而先增加后减少，料液比1∶50（g/mL）时达到最大值。当料液比为1∶40（g/mL）时，可能因溶剂量过少，抗氧化有效成分溶出量较少。而料液比超过1∶50（g/mL）后，溶剂量增加，茶汤中有效成分浓度降低，导致DPPH自由基清除率降低。因此，选择冲泡温度1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）进行响应面试验。

2.1.3冲泡时间

冲泡时间对DPPH自由基清除率的影响见图3。

如图3，朵贝茶中有效成分的DPPH自由基清除率总体先增大后减小，在4min时为最大值。在0至4min时，随着冲泡时间增加，朵贝茶茶汤中的有效成分逐渐增多。4min以后，部分有效物质被氧化，导致朵贝茶茶汤DPPH自由基清除率降低。8min时DPPH自由基清除率稍有上升可能是因为有其他物质溶出。因此，选择冲泡时间6、4、2min进行响应面试验。

图3 冲泡时间对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effectof tim eon the DPPH inhibition

2.1.4冲泡次数

冲泡次数对DPPH自由基清除率的影响见图4。

如图4，随着冲泡次数的增加，朵贝茶茶汤DPPH自由基清除率随之降低，前2次冲泡的茶汤DPPH自由基清除率明显高于后几次。表明第1次冲泡后茶叶中还有较多的抗氧化活性成分未浸出，冲泡第2次时抗氧化活性成分溶出虽有降低但仍在大量浸出，而冲泡至3次～6次时抗氧化活性成分溶出明显减少，尤其是冲泡次数超过4次，茶汤口感明显变差[13]。考虑茶质和汤色，冲泡次数选择1次～3次较好。

2.1.5水质

水质对DPPH自由基清除率的影响见图5。

图5 水质对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effectofwater on theDPPH inhibition

如图5，超纯水和纯净水冲泡的抗氧化活性大于自来水和矿泉水。分析原因可能是自来水含无机盐和多种微量元素与茶汤中的有效成分结合，导致DPPH自由基清除率减小。考虑到日常生活的应用性，因此，选择纯净水为冲泡水质。

2.1.6其它冲泡因素

其他因素对DPPH自由基清除率的影响见图6。

图6 其他因素对DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effectof other factorson theDPPH inhibition

如图6，选用盖瓷杯冲泡的茶汤抗氧化活性高于玻璃杯冲泡，朵贝特级茶冲泡的茶汤抗氧化活性高于朵贝普通级茶。另外，茶叶采用下投法的茶汤抗氧化活性高于上投法。故在日常生活中，冲泡器皿建议选择盖瓷杯及采用下投法冲泡优质朵贝茶。

2.2响应面分析及验证

2.2.1响应面试验结果与分析

综合以上试验结果，选择朵贝茶的A冲泡时间（min）、B冲泡温度（℃）和C料液比（g/mL）为自变量，依据Box-Behnken设计原理，设计17个试验点，响应值为朵贝茶的DPPH自由基清除率（%），结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 响应面设计与结果Table2 Resultsof response surfaceexperiments

表3 响应面方程的方差分析Table3 Analysis resultsof regression and variance

续表3响应面方程的方差分析Continue table3 Analysis resultsof regression and variance

通过响应面软件，得到回归方程为：朵贝茶DPPH自由基清除率/%=+72.6-0.94×C+0.53×A×B+ 1.80×A×C-0.65×B×C-1.83×A2-2.14×B2-3.01×C2。

2.2.2响应曲面优化和验证

根据回归方程得出各因素（A、B、C）所构成三维空间的响应曲面分析图。由图7～图9结果可知，料液比对DPPH自由基清除率的线性效应极显著，比较各因子间交互作用，冲泡时间与冲泡温度、冲泡温度与料液比交互作用均显著，冲泡时间、料液比对DPPH自由基清除率的曲面效应极显著。此时，该方程P＜0.000 1，极显著，其校正决定系数R2Adj=0.975 4，相关系数R2=0.989 2，说明该模型与试验拟合度较好，应用此响应曲面法优化朵贝茶抗氧化的冲泡工艺是可行的。

图7 料液比和温度交互作用的响应面图Fig.7 Response surfaceof solid-liquid and temperature

图8 料液比和时间交互作用的响应面图Fig.8 Responsesurfaceof solid-liquid and time

图9 时间和温度交互作用的响应面图Fig.9 Response surfaceof tim eand tem perature

通过响应面法优化朵贝茶冲泡条件为：料液比1∶48.09（g/mL），温度80.37℃，时间3.79min，此时朵贝茶的DPPH自由基清除率为72.69%。考虑到日常情况，朵贝茶的冲泡工艺优化为：料液比1∶48（g/mL），温度80℃，时间3.8min，在此优化条件下重复试验，最终得出朵贝茶的DPPH自由基清除率试验值为72.63%，接近响应曲面回归方程值72.69%。

3结论

本文以抗氧化活性为评价指标，分别探讨了茶叶等级、水质、冲泡器皿、投放方法、单次冲泡时间、冲泡温度、料液比、冲泡次数等8个因素对朵贝茶DPPH自由基清除率的影响。采用中心组合试验设计进行响应面分析，研究冲泡时间、冲泡温度和料液比对朵贝茶抗氧化活性的影响，最终确定最佳冲泡条件为：时间3.8min，温度80℃，料液比1∶48（g/mL），此时朵贝茶的抗氧化活性达到最高，DPPH自由基的清除率达72.63%。朵贝茶是贵州历史名茶、国家地理标志保护产品、安顺市地方特色产品，对于朵贝茶资源的开发，可变资源优势为经济优势，推动地方经济发展。

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Optim ization of Brew ing Conditions for the Antioxidant Activity of Duobei Tea by Response Surface M ethod

GUO Jian-jun1，ZHOUYi2，SUNHai-yan3，WANGWan-ying4，XU Li-jia4
（1.CollegeofAgriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China；2.Schoolof Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang550000，Guizhou，China；3.Shenzhen InstitutesofAdvanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，China；4.Institute ofMedicinalPlant Development，Chinese Academy ofMedicalSciences，Beijing100193，China）

DuobeiTeawasused asmaterial to study ofbrewing temperature，brewing time，material liquid ratio andwaterquality by using DPPH free radicalscavenging rate.And through the response surface analysis to optimize brewing conditionsof Duobei Tea.Our result indicated that the bestbrewing conditionswerematerial liquid ratio 1∶48（g/mL），brewing time 3.8min and brewing temperature 80℃.At this time the tea ofDPPH free radicalscavenging ratewas thehighestavailable.The studieshad shown that the tea had good antioxidantactivity under the optimalprocess conditions.DuobeiTeawith good antioxidantactivity had the potential to be developed as a natural antioxidant.For scientifically drinking and utilizing of Duobei Tea provides valuable references.

DuobeiTea；antioxidantacitivity；dailybrewing tea；responsesurfaceanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.023

2016-10-26

贵州省科技合作计划（黔科合LH字[2015]7693号）；贵州省教育厅青年科技人才成长项目（黔教合KY字[2016]277）

郭建军（1986—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：应用生物化学与天然产物研究。