依普利酮部分逆转甲状腺激素诱导的心肌电重构

赵 璐， 易甜甜， 罗水莲， 苏 立

(重庆医科大学附属第二医院心内科，重庆 400010)

依普利酮部分逆转甲状腺激素诱导的心肌电重构

赵 璐， 易甜甜， 罗水莲， 苏 立△

(重庆医科大学附属第二医院心内科，重庆 400010)

目的： 研究醛固酮拮抗剂依普利酮对甲状腺激素(T3)诱导的心肌电重构的影响。方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞，并随机分为对照组、T3组、依普利酮(Epl)组、T3+Epl组，采用免疫荧光法鉴定心肌细胞，CCK-8法检测T3与依普利酮对心肌细胞存活率的影响，细胞免疫荧光法、real-time PCR法、Western blot法检测各组钾离子通道Kv1.5、Kv4.3,L型钙离子通道Cav1.2,缝隙连接蛋白40(Cx40)和Cx43 mRNA与蛋白的表达。结果：免疫荧光法显示所培养细胞为心肌细胞且95%以上横纹肌α-辅肌动蛋白(sarcomeric α-actinin, α-actinin)抗体染色阳性。与对照组比较，T3增加Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40 mRNA与蛋白的表达，减少Cx43 mRNA与蛋白的表达；Epl组Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40 mRNA与蛋白的表达降低，Cx43的表达升高；与T3组比较，T3+Epl组Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40 mRNA与蛋白的表达降低，Cx43的表达升高。结论：依普利酮可部分逆转甲状腺激素导致的心肌电重构。

心肌细胞； 甲状腺激素； 依普利酮； 离子通道； 缝隙连接蛋白

心肌电生理特性取决于诸多离子通道的离子交换功能，离子通道是心肌细胞电活动产生的基础[1]。研究证实L型钙电流(L-type Ca2+current，ICa-L)、瞬时外向钾电流(transient outward K+current，Ito)、超快延迟整流钾电流(ultrarapid delayed rectifier K+current，IKur)与心肌电活动密切相关。同时，心肌细胞间的电兴奋通过缝隙连接进行传导，而缝隙连接蛋白40 (connexin 40, Cx40)与Cx43是细胞间缝隙连接的主要蛋白。因此，心肌细胞离子通道与缝隙连接的改变均可导致心肌的电重构。

甲状腺激素(thyroid hormone, T3)等体液因素可导致心肌细胞的电重构。动物实验发现L-甲状腺素可使大鼠心肌肥大，肥大的心肌质膜的表面积增大，离子通道相对密度减少的同时也导致多个离子通道蛋白的表达异常，出现强的致心律失常性[2]。近年来，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)参与心肌重构得以证实[3]。依普利酮(eplerenone，Epl)作为新型选择性醛固酮受体拮抗剂，与盐皮质激素受体结合，抑制醛固酮受体复合物的形成，从而影响由醛固酮受体复合物引起的一系列病理反应，且与性激素相关的副作用较螺内酯少，因此受到广泛关注[4]。但依普利酮是否能逆转甲状腺激素诱导的心肌电重构尚无明确定论。因此，本研究拟通过甲状腺激素处理原代心肌细胞，观察依普利酮对甲状腺素所致心肌电重构的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 SPF级新生1～3 d龄SD乳鼠，雌雄不拘，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物合格证编号为CQLA-2014-0187。

1.2 主要药物与试剂 高糖DMEM培养基、胎牛血清(Gibco)；Ⅱ型胶原酶、5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine，5-BrdU)、甲状腺激素、胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)；依普利酮(Aladdin)；CCK-8试剂盒(Dojindo)；抗横纹肌α-辅肌动蛋白(α-actinin)、Kv1.5抗体(Santa Cruz)；抗Kv4.3、Cav1.2抗体(Novus)；抗Cx40、Cx43 抗体(BIOSS)；抗GAPDH 抗体(天德悦)；Cy3标记的山羊抗兔抗体、FITC 标记的山羊抗兔抗体、辣根过氧化物酶HRP标记的抗体、DAPI染色液(碧云天)；TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒、real-time PCR 试剂盒(TaKaRa)。

2 方法

2.1 原代心肌细胞的分离培养与鉴定 取1～3 d龄的SD乳鼠，在无菌条件下取下乳鼠心肌组织，用0.125%胰蛋白酶及0.08% Ⅱ型胶原酶多次混合消化后离心，收集细胞悬液，接种于6孔板中，采用差速贴壁法和5-BrdU纯化心肌细胞，用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱培养，40 h后换液。采用细胞免疫荧光法鉴定原代心肌细胞。

2.2 CCK-8法检测T3与依普利酮对心肌细胞活力的影响 按每孔接种1×104个细胞的密度将心肌细胞接种于96孔板。分别加入含0、1、2、5、10、100 nmol/L T3的培养基和含0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L依普利酮的培养基，分别在培养24 h后加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，使用酶标仪于450 nm处读取吸光度(A)值。细胞存活率=(A实验组-A空白孔)/(A对照组-A空白孔)×100%。每组设5个复孔，空白孔为未加细胞悬液的培养基。根据此结果选取最适T3和依普利酮的处理浓度。

2.3 实验分组 实验以原代培养3 d后的心肌细胞作为研究对象。实验前更换无血清培养基处理24 h，使细胞生长趋于同步化，再加入各干预因素培养24 h。实验分为4组，分别为对照(control)组、T3(10 nmol/L)组、Epl(10-6mol/L)组和T3+Epl组(先加入10 nmol/L T3，30 min后加入10-6mol/L依普利酮)。

2.4 细胞免疫荧光检测 将无菌盖玻片置于6孔板中，滴加细胞悬液，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，更换无血清培养基处理24 h，用4%多聚甲醛溶液室温固定15 min，加3‰ TritonX-100 37 ℃孵育10 min，用10%山羊血清配制的兔抗大鼠Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43 抗体4 ℃过夜。次日以山羊抗兔IgG-FITC 37 ℃孵育1 h，DAPI复染细胞核5 min，用抗荧光淬灭剂封片后，于倒置荧光显微镜下观察并摄片。采用Image J软件分析各组荧光图片的平均荧光强度(median fluorescent intensity, MFI)值。

2.5 Real-time PCR检测mRNA的表达 收集各组细胞，采用TRIzol法按提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。参照GenBank设计并合成引物，GAPDH的上游引物序列为5’-GGGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物序列为5’-GCCCTTCCACGATGCCAAA-3’；Kv1.5的上游引物序列为5’-GGGGCAAGATCGTGGGTTC-3’，下游引物序列为5’-CCTGCTCCTCGTGGTCTGTCT-3’；Kv4.3的上游引物序列为5’-CTGCCCTTCTCAACCCCAAATACTC-3’，下游引物序列为5’-ACCGCTTCAAAACACCAGGACTC-3’；Cav1.2的上游引物序列为5’-TCACCCCCAGCAGCTACTCATC-3’，下游引物序列为5’-CTGCGGGTCTCATCTGGAAACATA-3’；Cx40的上游引物序列为5’-GCACACTGTGCGCATGCAGG-3’，下游引物序列为5’-TGCTGGCCTTACTAAGGCG-3’；Cx43的上游引物序列为5’-ATCCAGTGGTACATCTATGG-3’，下游引物序列为5’-CTGCTGGCTCTGCTGGAAGG-3’。反应条件为：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH为内参照，目的基因mRNA的表达水平用2-ΔΔCt计算。

2.6 Western blot检测蛋白的表达 收集各组细胞，加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。取30 μg蛋白，经SDS-PAGE分离后，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭90 min，分别加入兔抗大鼠Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43单克隆抗体，4 ℃过夜，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG，室温孵育90 min，TBST 洗膜后ECL 显影。应用Quantity One 4.6.2凝胶电泳分析软件进行图像分析，以目的蛋白与GAPDH蛋白条带积分光密度的比值进行半定量分析。

3 统计学处理

数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较应用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌细胞培养与鉴定

细胞培养24 h后，经倒置显微镜观察，大部分细胞已贴壁，成梭形、多边形，部分细胞出现自发性搏动。培养48 h后呈多边形，三角形、梭形与不规则形细胞伸出伪足，呈聚集性生长，连接成片，搏动频率40～150次/分。使用心肌特异性标记的抗横纹肌α-actinin抗体鉴定心肌细胞，可见心肌细胞纯度达95%以上，见图1。

Figure 1.The images of the cell morphology (A, ×400) and the identification of primary cultured cardiomyocytes with immunofluorescence staining (B, ×200).

2 T3与依普利酮对心肌细胞存活率的影响

CCK-8法测定结果显示100 nmol/L T3处理组的心肌细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)，而1、2、5、10 nmol/L T3组与对照组比较，差异无统计学显著性。10-5mol/L依普利酮处理组的心肌细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)，而10-8、10-7、10-6mol/L T3组与对照组比较，差异无统计学显著性。据此结果选择10 nmol/L为T3处理浓度，10-6mol/L为依普利酮的处理浓度，见图2。

Figure 2.The concentration-response relationship of T3 and eplerenone on the viabilities of the cardiomyocytes by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 0 nmol/L (T3)； #P<0.05 vs 0 mol/L (Epl).

3 免疫荧光法评价T3与依普利酮对Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的蛋白相对表达水平的影响

与对照组比较，T3组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40的MFI升高(P<0.01)，Cx43的MFI降低(P<0.01)，Epl组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40的MFI降低(P<0.01)，Cx43的MFI升高(P<0.01)。与T3组比较，T3+Epl组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40的MFI降低(P<0.01)，Cx43的MFI升高(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The effects of T3 and eplerenone on the protein expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes by immunofluorescence staining (×400). Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs T3.

4 T3与依普利酮对Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43 mRNA表达的影响

T3、依普利酮干预24 h后，与对照组比较，T3组的Kv1.5、Cav1.2与Cx40的mRNA水平分别增加了2.61、2.01和2.44倍(P<0.01)，Kv4.3的mRNA水平增加了1.31倍(P<0.05)，Cx43的mRNA水平减少了63%(P<0.01)。Epl组Kv1.5和Kv4.3的mRNA水平分别减少了51%和48%(P<0.05)，而Cav1.2与Cx40的mRNA水平降低与对照组比较差异无统计学显著性，Cx43的mRNA水平则增加了1.45倍(P<0.01)。与T3组比较，T3+Epl组Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40的mRNA表达降低(P<0.01)， Cx43的mRNA表达升高(P<0.01)，见图4。

Figure 4.The mRNA expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes detected by real-time PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs T3.

5 T3与依普利酮对Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43蛋白表达的影响

与对照组比较，T3组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40 蛋白表达均升高，Cx43 蛋白表达降低，Epl组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40 蛋白表达均降低，Cx43的蛋白表达升高。与T3组比较，T3+Epl组的Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2与Cx40蛋白表达均降低，Cx43的蛋白表达升高，见图5。

讨 论

本研究证实甲状腺激素可诱导心肌细胞Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的表达发生改变，提示甲状腺素可导致心肌细胞电重构。既往研究已证实醛固酮拮抗剂可以改善心肌纤维化等结构重构，而对于电重构相关研究则较少。本研究结果提示醛固酮拮抗剂依普利酮可通过抑制Cav1.2、Kv1.5、Kv4.3、Cx40的mRNA及蛋白表达上调与Cx43的表达下调，在一定程度上改善甲状腺激素导致的心肌电重构。

ICa-L是心肌细胞重要的去极化电流，在动作电位2相开放，内流的Ca2+促进肌浆网释放Ca2+，触发心肌收缩偶联。心肌电重构时，进入细胞内Ca2+增多，并诱发肌浆网释放更多Ca2+，使细胞内Ca2+异常升高，细胞内钙超负荷，触发钙依赖式通道失活，使L型钙通道活性降低，L型钙离子通道Cav1.2电流密度下降，动作电位时程和有效不应期缩短，从而促进多环折返的形成，这是Cav1.2的mRNA及蛋白表达下降导致心律失常的可能机制[5-6]。L型钙通道Cav1.2的表达上调亦可导致细胞内钙超负荷，导致心肌电重构[7]。本研究发现在T3处理心肌细胞24 h后L型钙通道Cav1.2的mRNA及蛋白表达上调，依普利酮能逆转T3导致的Cav1.2上调。

钾离子流是心肌细胞动作电位复极的主要外向电流。Kv1.5与Kv4.3 分别是心肌细胞超快延迟IKur与Ito形成的基础。本研究结果提示，心肌细胞在T3干预后Kv1.5与Kv4.3 mRNA的表达分别升高2.61和1.31倍，且蛋白表达呈一致升高，表明在甲状腺激素诱导的心肌细胞中，钾电流可能由于Kv1.5与Kv4.3 的变化而发生变化，从而引起心肌细胞动作电位时程的改变，导致心肌电重构。有研究发现过表达Kv4.3可增加Ito电流密度，缩短动作电位时程，减少Ca2+内流[8-9]。因此,钾离子通道Kv4.3可通过调节跨膜Ca2+内流，引起L型钙通道变化，这可能是Kv4.3导致心肌电重构的原因之一。

Figure 5.The protein expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, Cx40 and Cx43 in the cardiomyocytes determined by Western blot. Mean±SD. n=5～7. *P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs T3.

缝隙连接蛋白在心肌细胞表面组成缝隙连接通道，是心肌细胞之间进行电化学信息交换的分子基础，其结构和功能的异常与心肌电重构的发生关系密切。Cx40主要分布于心房肌及浦肯野传导系统中，而Cx43广泛分布于心房肌及心室肌细胞，Cx40与Cx43是心房电激动传导的关键蛋白。本研究发现T3诱导的心肌细胞中Cx43 mRNA和蛋白的表达下调并伴有Cx40 mRNA和蛋白的表达上调，与Dupont 等[10]在心肌肥大患者心内膜表面发现的结果一致。但有关心肌电重构Cx43的表达存在争议，Cx43可在AngⅡ诱导的心肌细胞中的表达上调[11]，在压力超负荷犬的心肌中未见异常，但其分布不均[12]，而在甲亢大鼠中表达降低[13]。本研究结果提示，T3可使Cx43的表达下调，而Epl可部分逆转这一效应。研究结果不一致的原因不甚清楚，可能与不同的干预条件有关。结合国内外多项研究结果，我们推测，无论Cx43的表达升高或降低或分布异常，均打乱了缝隙连接通道蛋白的平衡，干扰了心肌细胞电化学的正常传导，导致了心肌细胞的电重构。

甲亢时心肌组织中AngⅡ水平升高。本课题组的前期研究也证实，甲状腺素诱导后心肌组织的AngⅡ水平升高，表明高甲状腺素诱导的心肌电重构中，有RAAS系统的参与[14]。醛固酮拮抗剂依普利酮可以通过盐皮质激素受体抑制醛固酮的活性。研究发现醛固酮拮抗剂依普利酮可通过激活生电钠泵，改善心肌纤维化，减少心脏结构重构及心律失常的发生[15],同时可通过调节肌浆网Ca2+-ATP酶的表达改善心衰大鼠的心肌电重构[16]。本研究结果显示，T3诱导的心肌细胞Kv1.5、Kv4.3、Cav1.2、Cx40和Cx43的改变可被依普利酮逆转，进一步提示醛固酮拮抗剂依普利酮可在一定程度上改善甲状腺激素诱导的心肌电重构。因此，醛固酮拮抗剂可能通过调节离子通道蛋白和缝隙连接蛋白表达而具有抗心律失常作用，我们将在后续的研究中，以全细胞膜片钳技术进一步证实其对上述离子通道电生理学功能的影响。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Eplerenone partly reverses thyroid hormone induced myocardial electrical remodeling

ZHAO Lu, YI Tian-tian, LUO Shui-lian, SU Li

(DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China.E-mail:sulicq@163.com)

AIM: To investigate the effects of eplerenone (Epl) on thyroid hormone (T3) induced myocardial electrical remodeling. METHODS:The ventricles of 1～3 d neonatal rats were digested with 0.125% trypsin and 0.08% collagenase type 2. The cell suspension was replated for 90 min to reduce the proportion of non-myocardial cells. The isolated cardiomyocytes were randomly divided into control group, T3 group, Epl group and T3+Epl group. The cardiomyocytes were identified by immunofluorescence staining. The viability of the cardiomyocytes was measured by CCK-8 assay. The expression of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2, connexin 40 (Cx40) and Cx43 at mRNA and protein levels was determined by immunofluorescence staining, real-time PCR and Western blot. RESULTS:The results of the cell immunofluorescence labeling conformed that the cultured cells were cardiomyocytes with more than 95% positive staining of sarcomeric α-actinin. Compared with control group, the mRNA and protein levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were increased, but the expression of Cx43 was decreased in T3 group. The mRNA and protein levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were decreased, but the expression of Cx43 was increased in Eplerenone group. Compared with T3 group, the mRNA and protein expression levels of Kv1.5, Kv4.3, Cav1.2 and Cx40 were decreased, but the expression of Cx43 was increased in T3+Epl group. CONCLUSION: Eplerenone partly reverses T3-induced myocardial electrical remodeling.

Cardiomyocytes; Thyroid hormone; Eplerenone; Ion channel; Connexin

1000- 4718(2017)03- 0428- 07

2016- 09- 26

2016- 11- 15

△通讯作者 Tel: 023-63693452; E-mail: sulicq@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.008