山楂叶原花青素多聚体对人脐静脉内皮细胞钙活化的影响*

李 澎， 王建农， 侯金才， 付建华， 刘建勋

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

山楂叶原花青素多聚体对人脐静脉内皮细胞钙活化的影响*

李 澎△， 王建农， 侯金才， 付建华△， 刘建勋

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

目的： 探讨山楂叶原花青素多聚体(PPC)对血管内皮细胞钙浓度的影响及其机理，以期阐明其血管活性的机制。方法: 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。以Fura-2标记细胞内钙离子，活细胞工作站连续测定细胞内钙离子浓度30 min。结果: 12.5～50 mg/L PPC可以浓度依赖地升高HUVECs内钙离子浓度，其作用方式与经典血管内皮细胞钙激动剂ATP明显不同。其中25和50 mg/L 的PPC效果与正常组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。抑制胞内钙释放，对这一作用没有影响；而去除胞外钙离子、使用钠钙交换体抑制剂以及去除胞外钠离子，均可显著抑制，甚至取消PPC的作用。结论: PPC具有显著的血管内皮细胞钙活化作用，这可能是其调节血管内皮细胞功能的机制之一。这一作用可能是通过促进胞内钠内流，激活钠钙交换体的逆向转运，从而引起胞外钙内流而达到的。

山楂叶； 原花青素； 血管内皮细胞； 细胞内钙离子

游离钙是人体细胞内极为重要的信号转导信使。它的浓度升高，即所谓“钙活化”，可以引起细胞内多种信号通路的激活或抑制，从而导致一系列的细胞功能和性状的变化，进而影响、调控、参与机体的各种生理、病理活动。目前对于胞内游离钙的研究，大多局限于可兴奋性细胞，如心肌、平滑肌以及神经细胞等。在这些细胞上，负责调控胞内钙离子浓度的主要是电压依赖性钙通道。而对于其它大量的非可兴奋性细胞，则研究相对较少。

血管内皮细胞对于人体循环系统的调控具有关键的作用。研究表明，血管内皮细胞绝大多数的功能活动依赖于细胞内钙离子浓度的升高，特别依赖于长时相的细胞内钙离子升高。例如，血管内皮细胞大量、持久地分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)，以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、乙酰胆碱、缓激肽等活性因子对血管内皮细胞调控功能的发挥，都需要胞内钙离子长时相的升高[1-2]。

山楂叶是一种重要的活血化瘀中药，具有“行气化瘀、降浊消脂”的功效，广泛应用于心血管疾病的治疗之中。山楂叶的主要活性成分包括黄酮和原花青素(procyanidins)。原花青素是一类由儿茶素和表儿茶素不同聚体构成的一类混合物；一般1～5聚体称为寡聚体，5聚体以上的称为多聚体。它的药理作用日益引起人们重视。山楂叶原花青素显示出远超山楂叶黄酮的作用强度，被认为是山楂叶提取物抗心肌缺血最主要的活性成分；葡萄酒中的原花青素被认为是抑制动脉粥样硬化、减少心血管疾病发病最关键的物质之一[3-4]。此外，原花青素还具有抗炎、抗肿瘤、调节血脂、抗动脉粥样硬化、改善认知、治疗老年痴呆等一系列广泛的药理作用，可以说是迄今发现的最重要的天然活性物质之一。

原花青素的药理作用可以归因于它的2个基本活性，即抗氧化和活化血管内皮细胞。对于前一个作用我们比较熟悉，已有大量的研究涉及。而对于后一个作用，目前的研究还不十分充分。事实上，原花青素可以激活血管内皮细胞的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，从而促进NO分泌，这一作用是独立于它的抗氧化作用的；而NO是最重要的血管活性物质之一，介导舒张血管、抗凝血、抗炎症等一系列作用，这些作用可以联系到原花青素绝大多数的药理活性[5]。研究显示，原花青素对血管内皮细胞NOS的激活作用是通过经典通路达到的。去除孵育液中的钙离子，则这一作用即被取消。这表明这一激活是外钙依赖的，它需要长时相的胞内钙离子升高和胞外钙离子内流[5]。但是原花青素对血管内皮细胞胞内钙影响的直接观察还未见报道，而与之相应的机制，也未得到阐明。

我们在本研究中观察了山楂叶原花青素多聚体(polymeric procyanidins，PPC)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)钙浓度的影响，并深入探讨了其可能的机制。这一研究对阐明山楂叶原花青素药理作用机制，揭示山楂叶活血化瘀本质，可能具有意义。

材 料 和 方 法

1 主要实验材料及试剂

剖腹产健康婴儿无菌脐带购自海淀妇幼保健院；阳性药ATP、EGTA和毒胡萝卜素(Sigma)；PPC由西苑医院实验中心制备，纯度>95%，方法参照文献进行[6]；35 mm玻璃底激光共聚焦培养皿(杭州欣友生物技术有限公司)；I型胶原酶(Gibco)；胰酶(Amesco)；内皮细胞培养基及其添加物(Cascade)；Fura-2和F-127(Biotium)； NiCl2·6H2O(Arcos)；氯化胆碱(国药集团)。

2 实验方法

2.1 HUVECs的培养与鉴定[7]将内皮细胞培养基添加物按1∶50的比例加入内皮细胞培养基，并加入青、链霉素(终浓度分别为100 U/L和100 μg/L)，配成完全内皮细胞培养基。

取剖腹产健康婴儿无菌脐带，约长20厘米。PBS 液洗净血迹，从脐静脉上端插入剪去针尖的12号针头，以止血钳固定。通过针头向脐静脉内注入PBS，冲洗3遍，洗净残血。以另一止血钳夹闭脐静脉下端，向脐静脉内注入以DMEM 配置的0.1% I型胶原酶，取出针头，夹闭脐静脉上端。37 ℃消化15 min。收集脐静脉内的消化液，并以PBS冲洗2～3遍，将流出液体与消化液合在一起，1 500 r/min离心10 min，取沉淀。

加入完全内皮细胞培养基，每条脐带所得细胞约加5 mL。将细胞加入培养瓶内，37 ℃、5% CO2条件下培养。

当细胞生长达到80%融合时，进行传代。PBS冲洗细胞，0.25%胰酶，37 ℃消化5 min，含5%血清的PBS终止消化。离心收集细胞，1∶3传代。实验使用第2～5代细胞。细胞按照1×107/L的密度接种于预先以1%明胶包被的激光共聚焦平皿上，培养24 h后，进行实验。

细胞的鉴定采用免疫荧光法。将第2代HUVECs按照3×107/L的密度接种于预先以1%明胶包被的无菌玻片上。培养24 h后，弃去培养基，PBS洗3遍，以冰冷的95%乙醇固定1 h。弃去乙醇，以兔抗人血小板VIII因子抗体和FITC标记的羊抗兔IgG检测，细胞核以DAPI染色。

2.2 实验用液的配制 KB液(mmol/L)：NaCl 132,KCl 5.9,MgCl21.2,CaCl21.5,D-葡萄糖11.5,HEPES 11.5,L-精氨酸0.1，以NaOH调pH至7.4；无钙KB液：KB液中不加CaCl2，代以1 mmol/L EGTA；无钠KB液：KB液中不加NaCl，代以132 mmol/L 氯化胆碱。

2.3 HUVECs胞内钙离子浓度的测定 弃去培养基，KB液洗3遍。向平皿中加入KB液2 mL，再将8 mmol/L Fura-2溶液(DMSO配制)与20% F127溶液(DMSO配制)按1∶1混合后，按1∶2 000的比例加入。37 ℃孵育30 min。

弃去孵育液体，以实验用孵育液(根据不同需要，使用KB液、无钙KB液、或无钠KB液等)洗3遍。之后培养皿加入2 mL孵育液，置于IX-81活细胞工作站(Olympus)下，设定温度为37 ℃，选择一个视野(×200)，而后一直固定此视野进行观察。以340 nm和380 nm为激发波长，曝光时间均为500 ms，500 nm为发射波长，进行扫描，设定频率为1 s-1。以In Vivo软件进行测量分析，测定电生理相互独立的单个细胞内荧光强度的变化，共测定30 min。钙离子浓度以340 nm和380 nm激发的荧光强度(扣除背景后)的比值表示。一般每次实验测量视野下电生理相互独立的3个细胞的钙浓度，实验重复3次。以观测时段各观测点的荧光强度比值之和除以观测点的总数，计算该观测时段的平均荧光强度比值。

2.4 加药方式 ATP以水溶解，其余药物均以DMSO溶解。观测一段时间，记录钙浓度的基线后，加入药物于细胞孵育液，正常组细胞给予等体积的药物溶媒(水或DMSO)。

3 统计学处理

各组数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间差异采用单因素方差或多因素方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验，组内前后比较采用配对t检验。

结 果

1 HUVECs的鉴定

胞核呈蓝色；抗人血小板VIII因子阳性的细胞，胞浆发出绿色荧光,阳性率在95%以上,见图1。

Figure 1.The identification of cultured HUVECs(×100). A: the image of cultured HUVECs in the third passage， showing a paving stone-like feature. B: the FITC immunofluorescence image for detecting the platelet-related factor VIII on HUVECs of the third passage.

2 Fura-2染色

胞内Fura-2荧光信号强烈,背景无着色，信噪比良好,见图2。

Figure 2.The images of the HUVECs labeled with Fura-2 (×200). The yellow, blue, and pink circles indicate the observation areas, which are electrophysiologically independent single cells. The yellow triangle indicates the background.

3 PPC显著升高HUVECs胞内钙离子浓度

正常对照组HUVECs胞内钙离子浓度保持稳定，在加入溶媒前后没有显著的变化。阳性药ATP(100 μmol/L)加入后，立即引起胞内钙离子的显著升高，持续约几十秒，根据文献，此过程由细胞内质网钙释放引起；之后胞内钙缓慢地下降，出现一个长达数十分钟的平台期，此过程为胞外钙离子内流所致(图3)。这一结果与文献报道[1-2]的一致，表明本实验的方法是可靠的。

PPC引起的钙活化过程与ATP不同。加药后胞内钙水平先保持不变，约8 min后，缓慢上高，至加药后15 min左右达峰，此后一直维持在此水平，呈现一个平台期。12.5～50 mg/L 的PPC剂量依赖地升高细胞内钙浓度；其中25和50 mg/L 组与正常组比较，差异有统计学显著性(P<0.01),见图4。

Figure 3.The traces of calcium concentration changes in the single cell treated with ATP at 100 μmol/L.

4 PPC的钙活化作用依赖于外钙内流

无论以无钙KB液孵育细胞，还是在加药后胞内钙升高到达平台期后，加入1 mmol/L EGTA(钙离子的螯合剂，用以去除细胞外液中的钙离子)，均可以显著抑制HUVECs胞内钙离子浓度的升高，见图5、6。

5 PPC的钙活化作用不依赖于内钙释放

使用细胞内质网钙-ATP酶的抑制剂毒胡萝卜素(4 μmol/L)，预先作用1 h,PPC的药效没有受到明显的影响，见图7。

Figure 4.The effect of hawthorn leaf polymeric procyanidins (PPC) in the changes of calcium concentrations of the HUVECs. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of intracellular calcium concentrations elicited by the PPC treatments. The delta average ratio (F340/F380) was acquired by subtracting the average ratio before the drug treatment from that after the drug treatment. The differences between groups were examined with one-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. ** P<0.01 vs normal group.

Figure 5.The PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs was abolished in calcium-free incubation solution. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the PPC-induced changes of intracellular calcium concentrations. The inter-group differences were examined with two-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. *P<0.05 vs with calcium.

Figure 6.The PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs was inhibited by EGTA. EGTA at 1 mmol/L was added into the incubation solution after the intracellular calcium concentration elevated to the plateau. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the comparison of the average intracellular calcium concentration in the plateau to that after the addition of EGTA. The differences between calcium concentrations of the plateau and that after EGTA treatments were examined with two-way ANOVA followed by paired t test. Mean±SD. n=9. **P<0.01 vs plateau.

Figure 7.Thapsigargin (TG) had no effect on the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. The cells were pretreated with 4 mmol/L TG for 1 h before the treatments of PPC. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of intracellular calcium concentrations after the treatments of PPC with or without TG pretreatments. Mean±SD. n=9.

6 PPC诱导HUVECs胞外钙内流的作用与钠钙交换体的逆转运有关

使用3种钙库操控性钙通道(store-operated calcium channels，SOC)抑制剂(50 μmol/L 2-APB、1 mmol/L LaCl3和1 mmol/L GdCl3)、1种环核苷酸门控钙通道的抑制剂(500 μmol/L diltiazem-HCl)以及1种钠钙交换体的抑制剂(4 mmol/L NiCl2)对HUVECs钙内流进行抑制。只有NiCl2能够显著抑制PPC介导的胞内钙浓度升高，见图8。

7 PPC诱导的外钙内流与钠内流有关

一般在钠钙交换体出现逆转运之前，胞内应该先出现一个钠超载的过程。我们在证明PPC诱导内皮细胞外钙内流与钠钙交换体出现逆转运有关后，又接着探讨了这一作用是否与钠内流增加有关。我们以氯化胆碱代替孵育液中的氯化钠(等摩尔替换)，以去除细胞外液的钠离子，从而阻断钠内流。结果显示，在无外钠的情况下，PPC的作用完全消失，见图9。

讨 论

血管内皮细胞上存在着一套与电压依赖性钙通道大为不同的胞内钙调控体系，目前认为主要有SOC调控系统、钠-钙交换体系统、环核苷酸门控钙通道等[1-2]。

SOC调控系统主要由两部分构成，一是细胞内质网上的钙通道，另一个是胞膜上的SOC。在刺激因素的作用下，内质网上的钙通道开放，导致钙离子释放入胞浆，使胞内的游离钙一过性升高。若无后续的胞外钙离子内流，胞内超出正常水平的钙离子将由内质网上的钙-ATP酶重新摄取回去，胞内游离钙水平重新恢复正常。如果内质网钙离子的释放进行得足够强烈，使内质网的钙储存被清空，则导致胞膜上的SOC被激活，胞外钙大量内流，使胞内游离钙水平持续升高，可长达几十分钟。ATP就是通过SOC调控系统起作用的。它是迄今为止研究最清楚的血管内皮细胞钙激动剂[1-2]。而使用毒胡萝卜素抑制内质网上的钙-ATP酶，就可以预先清空内质网的钙存储，从而阻断胞内钙的释放[1-2]。

Figure 8.NiCl2 inhibited the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. NiCl2 at 4 mmol/L was added into the incubation solution after the intracellular calcium concentration reached to the plateau. A: the traces in calcium concentration changes in the single cell; B: the decreases in intracellular calcium concentrations from the plateau after the addition of NiCl2.The differences between groups were examined with one-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. ** P<0.01 vs normal.

Figure 9.Deletion of sodium from the incubation solution abolished the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. The deletion was acquired by replacing sodium chloride with choline chloride of equal moles. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of calcium concentrations after the PPC additions. Mean±SD. n=9.

钠-钙交换体系统主要依赖胞膜上钠-钙交换体的逆向转运。正常情况下，钠-钙交换体向胞外排出1个钙离子，同时向胞内泵入3个钠离子，此即顺向转运。但是在胞内钠超载、pH值下降等情况下，钠-钙交换体会向胞外排出钠离子，向胞内泵入钙离子，即发生逆向转运。这一过程也会导致胞内钙离子浓度长时间升高，但不一定需要内质网的钙释放；而胞内钠浓度的升高却往往是必须的[8]。

环核苷酸门控钙通道位于胞膜上，主要由cAMP等第二信使激活，也可介导胞外钙内流，导致胞内钙的长时间升高[9]。

从本实验的结果看，PPC显示出与ATP截然不同的动力学特征，它不引起胞内钙的瞬间升高，作用相对缓慢；这提示两者可能具有不同的作用机制。这也为我们后续的实验所证实，即PPC引起的血管内皮细胞钙活化不依赖于细胞内钙释放和SOC途径，而是通过激活钠钙交换体，引起外钙内流而达到的。

以往对细胞外钙内流的研究多关注于SOC通道。近年来的研究显示，钠-钙交换体是一个很有前途的潜在靶点。钠-钙交换体主要表达于细胞膜上。它由大约970个氨基酸构成，分为9个跨膜片段和一个胞浆环状结构。根据不同的组织分布，钠-钙交换体可分为3型；钠-钙交换体1是普遍型，广泛分布于全身各种组织、器官；而钠-钙交换体2和3则主要分布于脑和骨骼肌。

钠-钙交换体在神经细胞、心肌细胞等可兴奋细胞中，得到了较多的研究。在脑、心肌等缺血再灌注损伤中，钠-钙交换体异常活化，逆向转运显著增强；而敲除钠-钙交换体基因、抑制其表达、逆向转运功能，则可以显著降低细胞的钙超载，从而减轻损伤，提示了其在发病中起关键作用[10]。

在血管内皮细胞等非兴奋性细胞中，目前钠-钙交换体的研究相对较少。有研究表明，血管内皮细胞也显示出钠-钙交换体活性，分布于其上的为1型钠-钙交换体。抑制或敲除钠-钙交换体，则显著抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞钙内流、ERK1/2磷酸化，以及细胞的增殖、迁移和管型分化[11]；同样，抑制或敲除钠-钙交换体，也可以阻断凝血酶以及胰酶活化受体激动剂诱导的血管内皮细胞的增殖、迁移和管型分化[12]。这些研究都提示，钠-钙交换体很可能参与了多种血管活性因子、药物对内皮细胞的调控，在血管新生、炎症等一系列病生理过程中扮演重要角色。而我们的研究结果，也为这一推断增添了一个最新的注脚。当然，本实验所展示的，PPC促进内皮细胞钙活化的作用，是一个生理作用，对细胞、机体不起损害作用，相反还促进NO的产生，起到保健、治疗的作用。

至于钠-钙交换体是否为PPC的直接作用环节。从本实验的结果来看，应该不是。PPC的直接作用环节应该还在其上游，即钠内流。这一结果也可以解释为何在加入PPC后，细胞内钙离子没有像加入ATP那样立即升高，而是经历了一个较长的潜伏期。这一潜伏期可能就是胞外钠内流，钠超载的过程。

钠内流增加可以通过激活内向钠通道，也可以通过抑制胞膜钠-钾ATP酶而达到。究竟PPC作用于哪个环节，还需要进一步的研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effects of hawthorn leaf polymeric procyanidins on calcium mobilization in human umbilical vein endothelial cells

LI Peng, WANG Jian-nong, HOU Jin-cai, FU Jian-hua, LIU Jian-xun

(XiyuanHospital,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicalSciences,Beijing100091,China.E-mail:pengli1972cn@126.com；jianhuaffcn@263.net)

AIM: To observe the effects of hawthorn leaf polymeric procyanidins (PPC) on calcium mobilization of vascular endothelial cells, and to study the underlying mechanism. METHODS: Free calcium in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was labeled with Fura-2. HUVECs were treated with ATP, a positive control drug, and PPC at concentrations of 12.5， 25 and 50 mg/L..The intracellular calcium concentrations were measured with a living cell microscope for 30 min. RESULTS: PPC concentration-dependently increased the intracellular calcium concentration of HUVECs. The intracellular calcium concentrations in 25 and 50 mg/L PPC groups were significantly higher than that in normal group (P<0.01). The dynamic manner of calcium concentration elevations elicited by PPC was a slow increase which happened after a latency time of several minutes, lasted for several minutes, and reached a plateau finally. This manner was quite different from that elicited by ATP, a typical SOC operator, hinting different mechanisms between them. Inhibiting the intracellular calcium release did not influence the effects of PPC; however, deleting extracellular calcium, inhibiting the reverse mode of Na+-Ca2+exchange, or deleting extracellular sodium, restrained or even abolished the effects of PPC.CONCLUSION: PPC elicits calcium mobilization in vascular endothelial cells, which may be one of the mechanisms of the vascular modulatory activity of hawthorn procyanidins. This effect may be achieved through inducing the influx of sodium and then activating the reverse mode of Na+-Ca2+exchange.

Hawthorn leaf; Procyanidins; Vascular endothelial cells; Intracellular calcium ion

1000- 4718(2017)03- 0392- 07

2016- 08- 31

2017- 02- 20

国家自然科学基金资助项目(No. 81274196)； 北京自然科学基金资助项目(No. 7092089)

△通讯作者 李澎 Tel： 010-62835610； E-mail： pengli1972cn@126.com; 付建华 Tel： 010-62879814； E-mail： jianhuaffcn@263.net

R363.2

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10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.002