PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及机制*

王 芳， 李 岩， 卢昕烁， 杨杰波， 刘方芳， 余雪松， 李 明△

(1广东药科大学基础学院， 2广州中医药大学基础医学院， 广东 广州 510006)

PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及机制*

王 芳1， 李 岩2， 卢昕烁1， 杨杰波1， 刘方芳2， 余雪松1， 李 明1△

(1广东药科大学基础学院，2广州中医药大学基础医学院， 广东 广州 510006)

目的： 从大气细颗粒物PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响，研究PM2.5对血管内皮细胞的毒性。方法: 体外培养血管内皮细胞株EA.hy926，用不同浓度的PM2.5染毒24 h后，用CCK-8法测细胞的活性，用DCFH-DA荧光标记法检测细胞内氧自由基生成情况，用流式细胞术检测细胞凋亡率，然后用Western blot法检测凋亡相关蛋白细胞色素C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达变化。结果: CCK-8法结果显示PM2.5对血管内皮细胞有明显的毒性，在浓度大于25 mg/L时可使EA.hy926细胞活性显著下降；PM2.5染毒24 h后可见DCFH-DA荧光染色增强，说明细胞内有大量的氧自由基形成；流式细胞术和Western blot检测证实PM2.5可以通过上调细胞色素C表达和活化cleaved caspase-9和cleaved caspase-3而诱导EA.hy926细胞凋亡。此外,用N-乙酰半胱氨酸抑制氧自由基生成可以抑制血管内皮细胞凋亡，提示PM2.5引起的细胞凋亡与氧化应激有关。结论: PM2.5可导致血管内皮细胞氧化应激水平增强和凋亡增加，这可能是其影响心血管系统功能的机制之一。

PM2.5； 血管内皮细胞； 氧化应激； 细胞凋亡

随着我国经济发展和城市化进程的不断加快，工业生产、交通和燃煤等所产生的大量颗粒物(particulate matter，PM)使大气污染问题日益严峻，并严重危害人体健康[1]。与健康相关的PM按其空气动力学直径可以分为PM10、PM2.5和PM0.1，PM的粒径越小，进入呼吸系统部位越深，尤其是PM2.5和PM0.1，现在研究证实其不仅可以沉积在肺泡，还可以穿透血气屏障进入血液循环[2]，因此目前大气污染除与呼吸系统疾病有关外，还可以影响心血管系统疾病的发生[3]。以上结果也得到了流行病的证实，调查显示灰霾天气时医院住院人数增多，人群总死亡率明显增高，其中以呼吸系统和心血管系统疾病患者为主[4-5]。

目前，PM2.5已经被认为是重要的心血管疾病危险因素之一，对于其作用机制，由于以往认为PM2.5主要通过造成肺部损伤引起全身炎症性反应，以间接作用的方式影响心血管系统疾病的发生[6]。直到近年来研究者发现PM2.5可以进入血液循环，才有学者提出PM2.5可能直接造成心血管系统毒性[2-3]。血管内皮细胞受损或功能障碍是动脉粥样硬化等心血管疾病发生的共同基础[7]，PM2.5进入血液循环后可与血管内皮细胞相接触，因此PM2.5可能通过直接影响内皮细胞功能来促进心血管系统疾病的发生。为研究该问题，本研究在体外培养血管内皮细胞，用PM2.5进行干预，从氧化应激和细胞凋亡两方面研究PM2.5对内皮细胞的影响，以期加深对PM2.5心血管系统毒性的认识。

材 料 和 方 法

1 仪器与试剂

1.1 主要仪器 AvantiTMJ25低温高速离心机(Beckman)；MCO-175 CO2培养箱(SANYO)；MS800显微镜(Olympus)；ELx800酶标仪(BioTek)；流式细胞仪(BD)；蛋白电泳仪、电转仪和凝胶成像仪(Azure Biosystems)。

1.2 主要试剂 PM2.5(Sigma)；胰酶、DMEM 培养基和胎牛血清(Gibco)；CCK-8试剂盒(Dojindo)；活性氧检测试剂盒H2-DCFDA(江苏凯基生物技术有限公司)；凋亡试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；抗β-actin抗体、抗caspase-3抗体和HRP标记的羊抗兔IgG(ABclonal)；抗caspase-9抗体(CST)；抗细胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)抗体(Abcam)；蛋白预染Marker(Thermo)；脱脂奶粉、蛋白定量试剂盒和RIPA细胞裂解液(上海碧云天生物有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 人血管内皮细胞EA.hy926株购自广州吉妮欧生物科技有限公司，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞活性的检测 取对数生长期的EA.hy926细胞，以每孔8×103个接种96孔板，分为对照组和不同浓度PM2.5染毒组(PM2.5终浓度分别为12.5、25、50、100和200 mg/L)，每组设6个复孔。根据实验分组，对细胞进行染毒，24 h后按照CCK-8试剂盒说明书，用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度(A)值，按公式计算细胞存活率。细胞存活率(%)=染毒组A值/阴性对照组A值×100%。

2.3 细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的检测 细胞以每孔1×106个接种于6孔板，分为对照组、不同浓度PM2.5染毒组(PM2.5浓度根据结果选择25、50和100 mg/L)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)处理组(以NAC 10 mol/L 预处理1 h后加入PM2.5 100 mg/L)。细胞孵育24 h后去除培养基，加入DCFH-DA探针(10 μmol/L)孵育90 min，用温PBS漂洗2次，然后用温无血清培养基继续培养30 min，置于荧光显微镜下观察拍照。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞分组和处理同上，孵育24 h后用无EDTA胰酶消化细胞，冷PBS离心洗涤2次，然后用400 μL binding buffer重悬细胞，先加入Annexin V-FITC 5 μL 4 ℃避光孵育15 min，再加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL，4 ℃避光孵育5 min后，立即以流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.5 凋亡相关信号分子的检测 实验分组和处理同上，24 h后用冷PBS洗涤3次，用含PMSF的RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞30 min，然后4 ℃、12 500×g离心5 min，收集上清液，用BCA法测量蛋白浓度。取30 μg蛋白进行SDS-PAGE分离、转膜。Western blot主要步骤如下：5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST清洗10 min、3次，加入相应Ⅰ抗(1∶1 000)，其中抗caspase-9抗体和抗caspase-3抗体可同时检测未活化的凋亡蛋白酶及被切割活化后的凋亡蛋白酶。4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入酶标Ⅱ抗(1∶3 000)，室温孵育1 h，最后用TBST清洗并用ECL法显色，凝胶成像系统拍照，用ImageJ分析软件分析条带的灰度值，用目标蛋白与β-actin灰度值的比值来表示蛋白的相对表达水平。

3 统计学处理

以GraphPad Prism 5统计软件进行分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多样本组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PM2.5对EA.hy926细胞的毒性作用

当PM2.5浓度为12.5 mg/L时， EA.hy926细胞的存活率虽然有所降低，但与对照组无显著性差异；当PM2.5浓度大于25 mg/L时，EA.hy926细胞存活率明显下降，与对照组相比差异有统计学显著性(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The viability of EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs 0 mg/L group.

2 PM2.5对EA.hy926细胞内 ROS水平的影响

荧光染色结果显示，对照组细胞在荧光显微镜下几乎看不到荧光，而PM2.5刺激后细胞内可见较强的荧光，且随着PM2.5浓度的增大荧光强度逐渐增加，说明PM2.5染毒可以使血管内皮细胞内ROS生成增多，引起细胞的氧化应激状态。以抗氧化剂NAC预处理后细胞内荧光强度明显减弱，说明NAC可减少PM2.5诱导的ROS生成，见图2。

Figure 2.The production of ROS in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h (×400).

3 PM2.5对EA.hy926细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示用25 mg/L的PM2.5作用于EA.hy926细胞，24 h后即可检测到凋亡细胞数增多，随着PM2.5浓度的增加，细胞凋亡明显增多，当PM2.5作用浓度为100 mg/L时，凋亡率是对照组的近4倍。实验还显示用NAC预处理后再给予PM2.5染毒可以减轻细胞凋亡，与对应浓度的PM2.5组比较细胞凋亡率明显下降，见图3。

Figure 3.Apoptosis of EA.hy926 cells induced by PM2.5 for 24 h detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

4 PM2.5对EA.hy926细胞凋亡信号分子的影响

PM2.5作用于EA.hy926细胞24 h后，与对照组相比，胞浆中的Cyt-C含量明显增高，同时cleaved caspase-9和cleaved caspase-3增加。实验中发现用抗氧化剂NAC预处理可以抑制PM2.5引起的上述信号分子改变，说明氧化应激参与了PM2.5引起的细胞凋亡，见图4。

讨 论

Figure 4.The levels of apoptosis-related proteins in the EA.hy926 cells exposed to PM2.5 for 24 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group; #P<0.05， ##P<0.01 vs 100 mg/L PM2.5 group.

近年来，PM对心血管系统的影响逐渐被研究者所认识[2-5]。流行病学和临床观察显示空气动力学直径小于2.5 μm的PM2.5升高可使包括动脉粥样硬化、心律失常和高血压在内的多种心血管疾病的发病率明显增高[8-9]，而降低PM2.5浓度则可以减缓动脉中层硬化(动脉粥样硬化的前期病变)的进程[10]，因此目前PM2.5 已被美国心血管协会认为是动脉粥样硬化发病的危险因素之一。

以往认为PM2.5主要通过造成肺部损伤引起全身炎症性反应来间接影响心血管系统功能[6]，然而近年来有研究在小鼠体内证实PM2.5除滞留在肺组织外，还可以借助巨噬细胞或上皮细胞间隙进入血液循环[11]，据此有研究者提出PM2.5对心血管系统的直接毒性作用，即PM2.5可能通过直接接触血管内皮细胞引起其功能改变或损伤最终促进心血管系统疾病的发生[3, 12]。目前有部分报道提出PM2.5可引起内皮细胞损伤，如万强等[13]证实广州等地的PM2.5可造成内皮细胞损伤，王菲菲等[14]证实燃煤来源的PM2.5能抑制血管内皮细胞增殖，但上述实验仅报道了PM2.5对细胞活性的抑制效果，对于PM2.5的作用机制并未进行探讨。同时为了避免PM2.5因采集地区和采集时间不同而造成的实验误差，本实验购买了由美国标准与技术研究院提供的PM2.5作为研究对象，该PM2.5作为标准品或对照品被用在多个有关PM2.5毒性的体内外实验中[15-16]。实验采用CCK-8法也证实PM2.5可以降低血管内皮细胞EA.hy926细胞的活力，和上述研究结论一致。在此基础上，我们进一步采用流式细胞术观察了PM2.5对血管内皮细胞凋亡的影响，结果显示PM2.5处理组血管内皮细胞凋亡明显强于对照组，在实验所用的最高浓度时细胞凋亡率是对照组的近4倍，证明引起细胞凋亡是PM2.5损伤血管内皮细胞的主要方式之一。

血管内皮细胞凋亡是多种心血管疾病发生的基础。线粒体通路是各种细胞毒性物质引起细胞凋亡主要途径[17]。其中主要步骤包括线粒体膜通透性增加，细胞Cyt-C释放到胞浆中，然后Cyt-C与凋亡蛋白酶激活因子结合，并募集caspase-9形成凋亡小体，caspase-9被激活后进而裂解激活下游的凋亡执行蛋白caspase-3，破坏细胞最终引起细胞凋亡。我们采用Western blot法证实PM2.5作用后细胞胞浆内Cyt-C的含量明显增高，caspase-9和caspase-3活化增加，说明线粒体途径可能是PM2.5引起细胞凋亡的机制之一。

氧化应激是线粒体损伤的常见原因，2015年Lawal等[18]报道PM2.5可上调血管内皮细胞ROS生成。我们用荧光标记法在显微镜下见到PM2.5刺激后血管内皮细胞内荧光染色明显增强，说明细胞内氧自由基产生增多，与其研究结果相一致。据此我们推测PM2.5可能通过诱导氧自由基生成进而损伤线粒体，使其通透性增加引起Cyt-C释放到细胞浆内，从而启动线粒体通路导致细胞凋亡。为了证实该推测，实验进一步采用NAC作为氧自由基清除剂进行了研究[19]。荧光染色结果显示加入NAC明显抑制了PM2.5诱导的血管内皮细胞氧自由基生成，同时NAC组与PM2.5组比较血管内皮细胞凋亡显著下降，胞浆Cyt-C含量降低、caspase-9和caspase-3活化减少，说明减少氧自由基生成可以抑制PM2.5引起的血管内皮细胞凋亡，证实了PM2.5诱导的内皮细胞凋亡与氧化应激相关。

综上所述，本实验发现PM2.5能够造成血管内皮细胞氧化应激，从而通过线粒体途径激活caspase-3诱导血管内皮细胞凋亡，这可能是其造成心血管毒性的机制之一，实验同时证实抑制细胞的氧自由基生成可以保护PM2.5造成的血管内皮细胞损伤，为防治PM2.5相关心血管疾病提供了研究思路。此外，由于本实验是采用体外细胞模型，将PM2.5直接施加于内皮细胞上来观察PM2.5的毒性作用，这种模型虽然是目前体外研究中常用的方法，但可能和体内并不完全一致，因此我们在后继研究中拟采用PM2.5呼吸道吸入的方式建立PM2.5染毒动物模型来进行进一步的研究。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Oxidative stress and apoptosis in endothelial cells exposed to PM2.5

WANG Fang1, LI Yan2, LU Xin-shuo1, YANG Jie-bo1, LIU Fang-fang2, YU Xue-song1, LI Ming1

(1SchoolofBasicCourses,GuangdongPharmaceuticalUniversity,2SchoolofBasicMedicalScience,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China.E-mail:Lim99011@163.com)

AIM: To study the toxicity of PM2.5 in the endothelial cells by investigating the induction of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in EA.hy926 cells exposed to PM2.5. METHODS: The endothelial cell line EA.hy926 was culturedinvitroand exposed to PM2.5 at different concentrations for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay and the generation of intracellular ROS was stained with DCFH-DA. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining, and the protein levels of cytochrome C, caspase 9 and caspase 3 was detected by Western blot. RESULTS: After the treatment with PM2.5, the viability of the EA.hy926 cells was decreased markedly and the production of ROS was increased significantly. PM2.5 exposure upregulated the expression of cytoplasm cytochrome C and activated caspase-9 and caspase-3, resulting in the increase of the cell apoptosis significantly. The ROS generation was directly involved in PM2.5-mediated endothelial cell apoptosis asN-acetyl-L-cysteine pretreatment abolished both ROS production and cell apoptosis induced by PM2.5. CONCLUSION: PM2.5 induces oxidative stress and apoptosis in the vascular endothelial cells, which may be one of the mechanisms that PM2.5 influences the function of cardiovascular system.

PM2.5; Endothelial cells; Oxidative stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0423- 05

2016- 10- 12

2016- 11- 01

广东省科技计划(No. 2014A020212266；No. 2016A020215156)

△通讯作者 Tel: 020-39352194； E-mail: Lim99011@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.007