异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响

2017-04-08任炳楠杨玉鹏张焕玲刘洪涛田冬冬

中国老年学杂志 2017年6期

关键词：甘草酸生长因子内皮

任炳楠杨玉鹏张焕玲刘洪涛田冬冬吴茵魏欣

(河北省人民医院，河北石家庄 050051)

异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响

任炳楠杨玉鹏张焕玲1刘洪涛田冬冬吴茵魏欣

(河北省人民医院，河北石家庄 050051)

目的探讨异甘草酸镁(MGIG)对肝癌小鼠模型肝癌前病变的作用。方法通过H22细胞皮下注射建立肝癌动物模型,在制模过程中给予MGIG 50 mg/kg和5-Fu 10 mg/kg进行干预,通过免疫组化法检测肝组织中的核因子(NF)-κB p65、血管内皮生长因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达，同时检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。结果 MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF表达和血清ALT、AST水平均小于5-Fu组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05%)。结论 MGIG对小鼠肝癌病变有一定的抑制作用，这种作用可能与抑制肿瘤细胞炎症因子有关。

肝癌;异甘草酸镁;核因子κB p65；肿瘤坏死因子α；血管内皮生长因子；H22细胞

异甘草酸镁(MGIG)是第4代甘草制剂，具有保护肝细胞膜、改善肝功能、延缓肝纤维化的作用，对急性肝损伤具有良好的防治作用〔1〕。研究表明甘草酸对肝纤维化过程中的炎性因子有抑制作用〔2〕，但其在肝癌中的作用尚需进一步证实。本研究应用H22细胞移植小鼠肝癌模型研究MGIG对小鼠肝组织中核因子(NF)-κB p65、肿瘤坏死因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况和血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)水平的影响，探讨MGIG对肝癌细胞炎性因子的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 动物健康雄性昆明小鼠,6周龄,体质量(25 ±5)g,清洁级,购自河北医科大学实验动物中心(动物合格证:1503010)。颗粒状饲料购自河北医科大学实验动物中心。

1.2 药品与仪器 MGIG购自江苏正大天晴制药有限公司；H22细胞来自河北医科大学基础医学院分子生物学教研室，NF-κB p65、TNF-α和VEGF试剂盒和盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色试剂购自博士德公司。显微镜和COMS纤维成像系统为日本奥林巴斯产品(BX51T-PHD-J11)，数据采集使用美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus，全自动生化分析仪使用日本TOSHIBA公司TBA-40FR。

1.3 分组及给药方法 53只昆明小鼠分为四组，其中随机取8只作为空白对照组，其余45只参照文献〔3〕用于建立肝癌小鼠模型，小鼠腹水型肝癌细胞株H22用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液常规传代培养。对数生长期细胞以质量分数0.9%的氯化钠溶液调整细胞密度至1×106个/ml，取0.5 ml细胞悬液接种于小鼠腹腔中，7 d后抽取小鼠腹水，用0.9%氯化钠稀释成1∶4的细胞悬液，0.2 ml/只接种于45只小鼠右侧腋窝皮下。24 h后将已经接种的小鼠随机分为三组：对照组(0.9%氯化钠注射液NS组)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组和MGIG+5-Fu组，每组15只，各组间小鼠质量差异无统计学差异(P> 0.05)。各组小鼠腹腔灌注给药(MGIG 50 mg/kg，5-Fu 10 mg/kg)，1次/d，连续给药7 d，末次给药24 h后摘取眼球取血，然后颈椎脱臼处死，解剖后观察肿瘤生长情况。

1.4 肝组织处理取出肝脏,在右前、右后肝叶最大直径处各取2 块,用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS,pH7.0 ～ 7.6,含0.1%DEPC)进行固定，24 h 之后进行石蜡包埋。

1.5 免疫组化指标和血清中生化指标的检测用免疫组化SP染色方法检测肝组织中NF-κB p65和VEGF及TNF-α的表达情况。切片常规脱蜡入水，使用抗原修复液水浴修复，滴加山羊血清封闭液，室温20 min。切片上滴加第一抗体，4℃过夜，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次×5 min；切片上滴加第二抗体，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mmol/L PBS洗3次×5 min；DAB显色，苏木素复染，水洗，中性树脂封片，DAB 显色，显微镜下观察。使用全自动生化分析仪测定血清ALT与AST的含量。

1.6 结果判定末次给药24 h 后，取肿瘤组织，称质量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量，均取平均值。免疫组化染色结果：NF-κB p65 阳性表达定位于肝细胞核和细胞质内，呈棕黄色颗粒。VEGF 染色呈棕黄色细颗粒表达于胞膜和胞质；TNF-α主要来自于单核细胞、吞噬细胞，染色呈黄色，表达于细胞膜或细胞质。参照文献〔7〕中标准，每张切片随机选择5 个视野,每个视野计数80～100个细胞,根据染色的深度及阳性细胞的数量分别计分:不着色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄色为3分。阳性细胞数<1%为0 分,1%～10%为1分,11%～50%为2分,51%～80%为3分,81%～100%为4分。

1.7 统计学方法应用SPSS16.0软件行独立样本的t检验。

2 结果

2.1 一般情况及肿瘤组织大小实验过程中,各组均无小鼠死亡。实验组小鼠肿瘤组织直径增大。NS组的肿瘤组织质量〔(3.29±1.21)g〕最大，与5-Fu组〔(0.83±0.26)g〕和MGIG+5-Fu组〔(0.4±0.14)g〕相比差异有统计学意义(P<0.05)，5-Fu组与MGIG+5-Fu组的抑瘤率分别为56.53%、84.80%，提示MGIG与5-Fu对肿瘤增长有抑制作用。MGIG+5-Fu组肿瘤组织质量小于5-Fu组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组化染色检测结果 NF-κB p65、TNF-α和VEGF阳性细胞主要呈弥漫性分布，见图1。各实验组NF-κB p65表达和ALT、AST水平与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。与NS组相比，5-Fu组和MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表达和ALT、AST水平均明显减少，差异有统计学差异。与5-Fu组相比，MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表达和ALT、AST水平均明显减少，差异有统计学意义。见表1。

图1 各组积分光密度(DAB)

组别n积分光密度NF-κBp65VEGFTNF-αALT(U/L)AST(U/L)空白对照组815.85±2.214.00±1.117.38±2.33142.15±5.8833.00±2.85NS组1547.53±9.971)39.40±3.051)66.53±3.651)193.33±14.231)62.80±4.981)5-Fu组1522.33±3.861)2)16.00±1.031)2)12.67±1.251)2)169.67±4.741)2)61.73±4.451)MGIG+5-Fu组1519.33±3.861)2)3)12.93±2.261)2)3)10.93±1.611)2)3)140.80±3.432)3)33.06±2.172)3)

与空白对照组相比:1)P<0.05；与NS组相比:2)P<0.05；与5-Fu组相比:3)P<0.05

3 讨论

肝癌的发生与NF-κB的表达密切相关，NF-κB 在肝癌组织中表达较高，是炎症致癌过程中主要的调节因子，活性增加可导致肿瘤体积增大，在炎症的刺激下，NF-κB磷酸化而抑制作用消失，使活化的 NF-κB进入细胞核而激活一系列的炎症因子〔7～10〕。在抗肿瘤的过程中抑制NF-κB 的活化可提高治疗效果。p65是NF-κB的亚基，参与调控下游基因的转录，具有转录激活的作用，可调控VEGF和TNF-α的表达，且与VEGF和TNF-α的表达正相关〔8〕。TNF-α是一种细胞因子，具有调节免疫应答、促进细胞生长分化的功能，能够活化巨噬细胞，增强淋巴细胞免疫功能，引起肿瘤血管损伤，抑制肿瘤血管形成。TNF-α体内浓度较低，适量对机体有保护作用，过量则对机体产生损伤反应〔9〕。TNF-α可通过激活NF-κB信号转导，促进肝癌细胞上皮间质转化，促进肝癌的侵袭转移〔10〕。VEGF是一种肿瘤血管生长因子，主要通过促进血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生成，表达水平与肿瘤恶性程度密切相关〔11〕。NF-κB 的激活可造成肿瘤组织对化疗的抵抗而导致治疗失败，抑制NF-κB的激活可以提高化疗的疗效，延缓疾病进展和复发〔7〕。MGIG是甘草酸单一异构体镁盐，能够显著抑制炎症因子TNF-α和NF-κB p65〔12〕。本结果表明，MGIG联合5-Fu干预H22小鼠肿瘤，能够明显抑制肿瘤生长、抑制肿瘤相关因子表达和抗血管生成，同时降低肝脏细胞的损伤。MGIG联合5-Fu能够明显降低小鼠肿瘤组织NF-κB p65、TNF-α和VEGF的表达，其机制可能与阻断NF-κB 下游通路、抑制TNF-α和VEGF的表达从而抑制肿瘤细胞的生长、增殖有关。

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11 郑安红,张维东,王兆朋,等.蝎毒多肽增强 5-氟尿嘧啶对 H22 肝癌抑制作用的机制研究〔J〕.中草药,2013;44(11):1465-9.

12 徐建国.异甘草酸镁抗皮炎湿疹药效学及其抗炎机制研究〔D〕.上海：第二军医大学,2010.

〔2016-03-18修回〕

(编辑袁左鸣)