套细胞淋巴瘤细胞Toll样受体9的表达及意义

李 爽 杨 阳 安倍莹 刘晓会 吴 静 白元松 崔久嵬 陈京涛

(吉林大学第一医院转化医学研究院，吉林 长春 130061)

套细胞淋巴瘤细胞Toll样受体9的表达及意义

李 爽 杨 阳 安倍莹1刘晓会2吴 静 白元松3崔久嵬4陈京涛

(吉林大学第一医院转化医学研究院，吉林 长春 130061)

目的 观察套细胞淋巴瘤细胞Toll样受体(TLR)9的表达及意义。方法 采用PCR检测TLR9基因的表达，采用流式细胞术检测TLR9蛋白的表达，采用免疫组化检测淋巴瘤患者淋巴结TLR的表达。采用Annexin V/PI双染检测CpG诱导套细胞淋巴瘤细胞的凋亡情况。结果 在套细胞淋巴瘤细胞系，TLR9基因水平和蛋白水平均高表达。套细胞淋巴瘤患者的淋巴结TLR9也有明显的表达。CpG-B刺激套细胞淋巴瘤细胞系后凋亡比例明显上升，并且具有时间和浓度依赖性。结论 TLR9在套细胞淋巴瘤细胞系高表达，CpG-B能够诱导套细胞淋巴瘤细胞凋亡。

Toll样受体；套细胞淋巴瘤；CpG寡聚核苷酸；凋亡

套细胞淋巴瘤(MCL)多发于中老年，男性患者居多，长期生存率低。传统MCL的治疗方法是化疗及放疗〔1，2〕,目前仍无明确的MCL治疗标准〔3〕。

模式识别受体(PRR)是天然免疫中十分重要的免疫受体，能够识别各种病原体〔4〕，引起快速免疫应答。Toll样受体(TLR)是PRR的一种〔5〕。研究表明TLRs在大多数血液系统恶性肿瘤中均有不同程度的表达,包括 B 系淋巴瘤细胞和骨髓瘤细胞等，具有重要的生物学效应〔6,7〕。CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)是TLR9的激动剂。CpG是一组从细菌 DNA 中提取的非甲基化的富含胞嘧啶鸟嘌呤的核苷酸序列〔8〕，主要分三型，A型主要活化浆细胞样树突细胞(pDCs)，B型主要活化B细胞〔9〕,C型是出现较晚的一种亚型，兼具A型和B型的活性〔10〕。NCL属于B细胞淋巴瘤，因此本研究主要选用B型CpG〔11,12〕。有研究报道，CpG-B能够诱导白血病细胞的凋亡〔13〕。本研究探讨MCL细胞TLR9的表达及意义。

1 材料和方法

1.1 细胞株及细胞培养 SP53，JEKO-1，G519，MINO，JURKAT细胞株均为ATCC购买并在本实验室保存。细胞培养基配制为RPMI1640(Corning公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，1%双抗 (Hyclone公司)。细胞株置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养，细胞为悬浮细胞系，不需胰酶消化，隔天传代即可。选对数生长期细胞进行实验。

1.2 qPCR检测 收集对数生长期SP53，JEKO-1，G519，MINO、JURKAT细胞1×106，选用EASY PureTMRNA试剂盒(北京全式金公司)提取RNA。再选用TranscriptTM两步法RT-PCR Super Mix试剂盒(北京全式金公司)将mRNA逆转录成cDNA。利用酶标仪检测cDNA的纯度和浓度，A260/280比值均介于1.8～2.0之间。将cDNA进行PCR扩增，扩增参数为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，进行35个循环；然后72℃延伸5 min。将扩增后的cDNA用于不同细胞株的琼脂糖凝胶电泳实验。同时将cDNA进行TLR9 qPCR实验，扩增参数为：95℃预变性10 min；95℃变性10 s，55℃退火30 s，进行40个循环。扩增引物：TLR9上游引物：5' TACCAACATCCTGATGCTAGACTC 3'，下游引物：5'TAGGACAACAGCAGATACTCCAGG3'。

1.3 流式细胞仪检测 收集对数生长期的SP53，JEKO-1，G519，MINO细胞，离心1 200 r/min,5 min。细胞计数5×105/管，用破膜液200 μl (BD公司) 将细胞团吹散，室温避光孵育20 min；取400 μl破膜缓冲液洗涤两遍，分别用TLR9抗体，同型对照(BD公司)抗体染色，室温避光孵育30 min，将染好的细胞洗涤两遍，流式细胞仪检测。采用Flowjo流式分析软件分析结果。

1.4 凋亡检测 收集对数生长期的SP53，JEKO-1，G519，MINO细胞，1×105/孔铺于24孔板，分别用CpG-B(CpG684,CpG2006,购自Invitrogen公司) 刺激细胞,各时间点利用Annexin V/PI试剂盒(BD公司)对细胞进行染色，流式细胞仪检测。CpG684序列：5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'，CpG2006序列：5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'。

1.5 免疫组化检测 取MCL患者淋巴结的病理切片，置于60℃恒温箱中放置1 h；分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15 min，进行脱蜡，乙醇进行水化后，洗涤3遍；再加热至沸腾的柠檬酸盐缓冲液15 min进行抗原修复，水洗两遍，PBS洗涤3遍；将组织切片在3%甲醇-H2O2中室温浸泡10 min，再用生物素阻断剂试剂盒进行封闭；一抗4℃过夜，PBS洗3遍；用生物素化二抗工作液在37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤3遍；辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃温箱孵育30 min，PBS洗涤3遍；DAB显色，封片；镜下观察(20×)。

1.6 统计学方法 采用Graph Prism5.0软件对数据进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 MCL细胞TLR9 mRNA表达 在SP53，JEKO-1，G519，MINO四种B细胞系TLR9 mRNA均有表达,阴性对照组T细胞系JURKAT的TLR9 mRNA表达量则很低，其中JEKO-1和MINO细胞上TLR9表达水平较SP53和G519高，见图1。

图1 RT-PCR检测不同细胞系TLR9 mRNA表达

2.2 MCL细胞TLR9蛋白表达 SP53、JEKO-1、G519、MINO细胞中TLR9的平均荧光强度(分别为1 203、1 560、1 315、1 487)高于同型对照(分别为985、902、013、898)，差异有统计学意义(P<0.05)。 JEKO-1，MINO两种细胞系TLR9的表达量较SP53，G519高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 免疫组化结果 正常淋巴结组织结构清晰，而MCL患者的淋巴结轮廓不清晰，组织结构被破坏，有大量棕褐色的阳性结果，说明TLR9在MCL细胞上高表达。见图2。

图2 TLR9表达的免疫组化结果(DAB，×200)

2.4 不同浓度CpG-B刺激TLR9诱导MCL的凋亡 本实验选用四种MCL细胞系SP53、JEKO-1、G519、MINO，99%以上细胞均为CD19+的B细胞，细胞系纯度满足实验要求。与阴性对照组相比，B型CpG684和CpG2006均能诱导MCL细胞的凋亡。在SP53，JEKO-1细胞系中，随着CpG684的浓度增加，诱导细胞凋亡的趋势增加，表明CpG-B能够诱导MCL细胞的凋亡，在SP53，JEKO-1细胞系中凋亡具有浓度依赖趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5 不同时间CpG-B刺激TLR9诱导MCL的凋亡 在CpG-B刺激MCL 1,3,5 d后，细胞凋亡比例明显增加。在MINO细胞系中，随着刺激时间的增加，CpG2006和CpG684诱导MCL细胞凋亡的比例呈增加趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

细胞系阴性对照组CpG6841μmol/LP值1)2μmol/LP值1)5μmol/LP值1)CpG2006(5μmol/L)P值1)SP5387.23±7.93079.42±7.2200.542272.16±6.5600.280770.62±6.420.245167.98±6.1800.1956JEKO-199.77±9.07094.16±8.5600.696990.09±8.1900.511386.79±7.8900.393294.82±8.6200.7306G51977.88±7.08068.31±6.2100.416567.32±6.1200.376370.51±6.4100.521065.67±5.9700.3181MINO89.32±8.12080.74±7.3400.515284.48±7.6800.707276.45±6.9500.351734.54±3.1400.02431)

1)与阴性对照组比较，下表同

时间点SP53阴性对照组CpG2006P值1)CpG684P值1)JEKO-1阴性对照组CpG2006P值1)CpG684P值1)1d84.15±7.65077.11±7.0100.567476.67±6.9700.544997.35±8.85092.73±8.4300.741889.10±8.1000.56273d85.69±7.79078.10±7.1000.546275.24±6.8400.419692.07±8.37077.11±7.0100.304177.66±7.0600.31885d77.11±7.01053.46±4.8600.109246.53±4.2300.0648100.8±9.16076.89±6.9900.174176.34±6.9400.1675时间点G519阴性对照组CpG2006P值1)CpG684P值1)MINO阴性对照组CpG2006P值1)CpG684P值1)1d76.89±6.99068.20±6.2000.450566.99±6.0900.397484.48±7.68084.04±7.6400.971382.28±7.4800.85643d73.15±6.65062.48±5.6800.346866.33±6.0300.526875.35±6.85073.26±6.6600.847171.28±6.4800.70815d78.32±7.12058.52±5.3200.155860.50±5.5000.186275.02±6.82053.90±4.9000.128462.70±5.7000.3000

3 讨 论

MCL是由体细胞基因突变引起的，B细胞大量扩增，病因不明。MCL多见于60岁左右的老年人，常规的治疗手段痛苦较大，复发率高且生存率低，并不适用于老年人。在国外，一些国家采用干细胞移植的方式，但这种治疗手段配型成功率低，且价格昂贵，普遍性受到限制。目前比较受关注的治疗方式有靶向治疗的生物制剂和免疫治疗，已有靶向药物进入临床试验〔14,15〕。但免疫治疗仍在研究中，人们期待能找到一种有效，可靠的MCL治疗方法。本研究结果表明，MCL肿瘤细胞高表达TLR9，TLR9的激动剂CpG-B能够诱导MCL凋亡。本文发现，SP53在第3天时出现明显凋亡，JEKO-1在第5天时出现明显凋亡，G519整体凋亡趋势不明显，MINO的凋亡具有时间依赖性，造成这种差异的可能因素有：①由细胞自身特性决定的，细胞系大多从病人体内分离得到，病人的个体差异使细胞系之间存在差异；②细胞成系较早，细胞的特性可能会发生一些改变，本实验中已对细胞纯度进行验证；③细胞培养时的状态会存在差异。若想确定凋亡是否具有CpG-B刺激时间或浓度依赖性，还需进一步研究验证。CpG在白血病中的应用颇受争议〔16，17〕，有文章报道称在CpG刺激白血病的肿瘤细胞后，能够促进肿瘤细胞的增殖，并称这一发现对于白血病的微量诊断具有重要意义〔18，19〕。也有研究显示白血病细胞能够表达TLR9，用TLR9的激动剂刺激后能够诱导肿瘤细胞的凋亡，对于白血病的治疗有重要意义〔13〕。本实验表明在MCL中TLR9的激动剂CpG-B能够诱导肿瘤细胞的凋亡。本实验为套细胞淋巴瘤的治疗提供了有力的依据，主要有以下两点：①TLR9在MCL上高表达，为MCL的治疗提供了新的靶点；②CpG-B能够诱导MCL的凋亡，可作为MCL免疫治疗靶向药物。

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〔2016-03-21修回〕

(编辑 曹梦园)

Expression and significance of Toll like receptor 9 on mantle cell lymphoma

LI Shuang,YANG Yang,AN Bei-Ying,etal.

Institute of Translational Medicine,the First Hospital of Jilin University,Changchun 130061,Jilin,China

Objective To explore expression and significance of Toll like receptor (TLR) 9 on mantle cell lymphoma (MCL).Methods MCL cell lines SP53,JEKO-1,G519,MINO and JURKAT were studied.The mRNA or protein expression of TLR9 on MCL cell lines were distinguished by PCR,flow cytometry,and immunohistochemistry.The apoptosis of MCL cell lines was induced by CpG-B treatment and detected by Annexin V and PI staining.Results The expression of TLR9 on MCL cell lines was examined.TLR9 were strongly expressed on the MCL cell lines and lymph nodes from MCL patients.CpG-B,the ligand of TLR9 could induce the apoptosis of MCL cells,which was dose and time dependent.Conclusions MCL cells showed high expression of TLR9,CpG-B could induce tumor apoptosis.

Toll like receptor 9;Mantle cell lymphoma;CpG;Apoptosis

国家自然科学基金(81571534)；吉林省科技发展计划项目(国际合作项目)(3D512K213428)；吉林省发展与改革委员会项目(2014N147)；吉林省科技厅国际合作项目(20140414014GH)

陈京涛(1967-)，女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤免疫学研究。

李 爽(1989-)，女，硕士在读，主要从事肿瘤免疫学研究。

R73-36

A

1005-9202(2017)06-1310-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.004

1 吉林大学第一医院检验科 2 安阳市肿瘤医院

3 吉林大学中日联谊医院肿瘤血液科

4 吉林大学第一医院肿瘤中心