SH-SY5Y 神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对钙调蛋白表达的影响

张淑丽 吕园园 官志忠 李 毅 齐晓岚

(贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

SH-SY5Y 神经细胞中α7神经型尼古丁受体基因过表达对钙调蛋白表达的影响

张淑丽 吕园园 官志忠1李 毅 齐晓岚

(贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

目的 构建稳定的α7神经型尼古丁受体(α7 nAChR)过表达的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，研究α7 nAChR过表达对钙调蛋白(CaM)表达水平的影响。方法 设计α7 nAChR引物并扩增α7 nAChR 特异性编码的核苷酸序列，退火后克隆至pcDNA 3.1 质粒，构建α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒。将α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒转染SH-SY5Y细胞，用含G418的培养液筛选，挑选阳性克隆后采用实时荧光定量(Real-time)PCR和蛋白质印迹方法检测转染细胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表达水平的变化，蛋白质印迹方法检测CaM表达水平的变化。结果 构建的α7 nAChR mRNA过表达质粒成功转入SH-SY5Y细胞后，经G418筛选获得稳定转染细胞克隆株，与对照组相比，α7 nAChR mRNA及蛋白表达量分别增加了533%和110%，CaM表达量增加了43%。结论 成功构建了α7 nAChR mRNA过表达的SH-SY5Y细胞株，α7 nAChR表达上调增加了CaM表达水平，这可能与阿尔茨海默病的发病有一定的关系。

α7神经型尼古丁受体；钙调蛋白；SH-SY5Y 细胞

阿尔茨海默病(AD)以进行性认知功能损伤和记忆障碍为特征的一种中枢神经系统退行性疾病。AD发病早期，胆碱能系统内Aβ沉积的同时伴有α7神经型尼古丁受体(α7 nAChR)的表达减少。此外，AD 早期胆碱能损伤也与α7 nAChR表达以及功能异常有关。α7 nAChR能通过协助第二信使钙离子，参与调节神经系统的兴奋性、神经递质的释放、长时程增强(LTP)诱导、改善学习以及记忆能力。在AD患者中，α7 nAChR的激活也会改善患者的注意力、学习及记忆能力。因此，α7 nAChR与AD发病早期有重要的关系。研究表明，促进大脑胆碱能具体信号的调节，增强AD患者的认知能力，最终改善其病症可能是由于α7 nAChR的激活〔1～3〕。本研究用体外合成的mRNA增强细胞内的α7 nAChR表达，研究其表达增加后钙调蛋白(CaM)的表达水平，从而探讨α7 nAChR对CaM表达水平的影响及其在AD发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验保存的人脑神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株；HindⅢ、BamH Ⅰ、DEPC购自华美公司；DMEM 高糖培养基、胰酶、双抗购于HyClone 公司；OPTI-MEM培养基、血清、二甲亚砜(DMSO)购于Gibco公司；由上海生工生物工程技术服务有限公司合成针对 α7 nAChR 的核苷酸模板引物序列；Genopure Plasmid Midi Kit、G418 Solution、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 购于 Roche 公司(德国)；Trizol 试剂、逆转录试剂盒、琼脂糖、溴乙啶(EB)、5×TBE、6×上样缓冲液购于Invitrogen 公司(美国)；兔抗CaM(FL-149)：sc-5537多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体：sc-81178及HRP标记的抗鼠二抗：sc-2005购于 Santa Cruz Biotechnology Inc (美国)；兔抗α7多克隆抗体购于Genetex(美国)；辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗兔二抗#7074购于CST(美国)；聚乙烯二氟 (PVDF)膜、ECL-Plus 发光试剂、高效显影胶片购自 Amersham 公司；Real time PCR 所用试剂均购于Roche公司；普通化学试剂购于 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 α7 nAChR-pcDNA3.1 表达质粒的构建 根据GenBank提供的基因序列，应用Ambion公司网站提供的软件设计α7 nAChR的引物序列，α7 nAChR上游引物：5′-CCCAAGCTTATGCAGGAGGCAGATATCAGTGGC-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTACGCAAAGTCTTTGGACACG-3′。以上序列经Blast Search检测确认了其与α7 nAChR基因以外的人类已知序列无同源性，并由上海生物工程股份有限公司合成，其5′、3′末端分别是 BamHⅠ和 HindⅢ限制性酶切位点。运用逆转录PCR的方法获取人α7 nAChR基因之后电泳鉴定及回收。用T4 DNA 连接酶将其定向克隆至已线性化的质粒pcDNA 3.1之后，构建重组质粒。阴性对照组直接采用pcDNA 3.1空载体。将它们转化至DH5α大肠杆菌，挑取单克隆扩增培养，抽提去内毒素的细菌质粒DNA，酶切，电泳鉴定插入片段大小，双向测序鉴定插入的碱基序列核酸及方向。

1.2.2 细胞培养和稳定转染 用含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)的高糖DMEM培养基于5% CO2、37℃恒温中培养SH-SY5Y贴壁细胞。生长良好的细胞用0.25%的胰酶蛋白酶消化接种至六孔板，待其汇合度为80%左右时，在试剂说明书指导下进行GFP荧光质控，摸索最优转染条件。再分别将不同重组质粒转入培养良好的SH-SY5Y细胞，设空白对照组、阴性对照组(空载体)、转染组。于OPTI-MEM培养基中转染6 h后换10%血清的DMEM培养基，培养24 h之后，加0.8 g/L G418筛选培养基进行筛选，直至出现单克隆细胞。利用有限稀释法挑取阳性单克隆并进行扩增培养。收集阳性细胞测定α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平。实验重复3次，每次三个复孔。

1.2.3 实行荧光(Real-time)定量PCR检测α7 nAChR mRNA 表达水平 采用 Trizol一步法提取细胞总 RNA，逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行Real-time PCR。所用试剂为Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。引物序列参照王凡等〔4〕，α7 nAChR上游引物：5′-ACCACTCACCGTCTACTTCTCC-3′，下游引物：5′-CATCTGGGAAACGAACAGTCTT-3′，扩增片段167 bp；β-actin上游引物：5′-TGGCACCACACCTTCTACAATG-3′，下游引物：5′-TCATCTTCTCGCGGTTGGC-3′，扩增片段103 bp。采用ABI Step One Plus型实时荧光定量PCR仪(美国)，采集α7 nAChR及β-actin基因扩增各循环的荧光信号，以SDS2.1软件收集荧光和分析数据。分析结果时以β-actin为内对照，计算α7 nAChR基因在实验组与对照组的相对水平(RQ=2-△△Ct)。实验重复3次，每次3个复孔。

1.2.4 蛋白表达水平测定 收集细胞，提取细胞蛋白(裂解2 h，14 000 r/min离心5 min)，BCA方法定量，用Western印迹方法检测α7 nAChR、CaM蛋白表达水平，以β-actin为内对照。用ImageJ软件分析结果，计算α7 nAChR、CaM蛋白条带与β-actin蛋白像素灰度的比值作为蛋白表达相对水平。实验重复3次，每次3个复孔。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0 统计软件进行单因素方差分析及q检验。

2 结 果

2.1 质粒构建的鉴定 将α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳结果在约1 000 bp和5 000 bp处出现两个条带，与实验设计的α7 nAChR基因模板核苷酸长度相符，结果见图1。将重组质粒进行双向DNA序列测定得到测序结果与实验设计的模板核苷酸序列相符(图2)，进一步表明 α7 nAChR 基因的表达质粒构建成功。

M：DNA Marker (DL5000)；1、2、3、4泳道：α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒酶切图1 α7 nAChR-pcDNA 3.1重组质粒双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图

图2 α7 nAChR核苷酸序列测序峰图

2.2 最优化的转染条件 转染GFP 24 h之后在488 nm激发光波长下(蓝光激发绿光)进行倒置荧光显微镜观察GFP荧光标记率。根据荧光值，转染试剂∶质粒=3∶1，复合物体积为200 μl(六孔板)，孵育条件为常温、15 min时转染最佳，见图3。

图3 最优条件的转染GFP荧光图(×100)

2.3 转染α7 nAChR基因后其mRNA 及蛋白表达水平 SH-SY5Y细胞转染α7 nAChR-pcDNA 3.1质粒后mRNA 及蛋白表达水平〔分别为(533.3±120.2)、(2.161±0.187)〕分别增长533%及110%，与对照组〔分别为(0.999±0.001)、(1±0.102)〕相比差异有统计学意义(P<0.01)；而阴性对照组〔分别为(0.958±0.069)、(1.137±0.152)〕与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。说明已将α7 nAChR转入SH-SY5Y细胞，且增加了α7 nAChR mRNA和蛋白表达水平。见图4。

图4 转染α7 nAChR-pcDNA 3.1质粒后α7 nAChR蛋白表达水平

2.4 转染α7 AChR基因后CaM蛋白表达水平 转染α7 nAChR-pcDNA 3.1质粒后CaM蛋白表达水平(1.445±0.128)增长了43%，CaM蛋白表达水平与对照组(1±0.113)相比差异有统计学意义(P<0.05)。而阴性对照组(0.956±0.142)与对照组相比无差异(P>0.05)。说明上调α7 nAChR水平能增加CaM蛋白表达水平。见图5。

图5 转染α7 nAChR mRNA质粒后CaM蛋白表达水平

3 讨 论

胆碱能神经功能缺陷在AD 发病的机制中具有重要作用。nAChR是神经系统中一类非第二信使介导性神经递质结合的离子通道，由α和β2两种亚单位构成。它是以不同亚单位组合的五聚体，主要调控细胞内外K+、Na+和Ca2+等离子流动〔2〕，其含量的减少与AD发病相关〔3〕。nAChR广泛分布于中枢神经系统，α7nAChR是其中较为特殊的亚型，在海马和皮层神经元中高表达〔5〕，激活的α7nAChR可以调节神经元的兴奋性和神经递质释放〔6，7〕、改变突触可塑性〔8〕、帮助神经元抵御内外因素引起的损伤，维持正常的生理功能，且对维持记忆及认知功能十分重要。大量试验使用了α7 nAChR激动剂治疗一些神经退行性疾病与认知障碍如AD，表明加强α7 nAChR功能可能改善AD患者的学习、记忆缺失症状〔9，10〕。α7 nAChR受损是胆碱能神经元退化的关键因素。最近有研究表明，在老化过程中α7 nAChRs对维持认知功能、学习和记忆能力具有重要性，以及α7 nAChRs对海马突触可塑性的重要性〔11〕。研究表明，α7 nAChR对改善AD和精神分裂症患者的认知障碍有显著作用〔12，13〕。因此，α7 nAChRs已被确认为一种很有前途的治疗药物〔13〕。本研究将α7 nAChR mRNA片段转染到SH-SY5Y细胞中，其mRNA和蛋白表达水平明显增强，表明α7 nAChR mRNA能有效地增强内源性α7 nAChR的表达。

AD发病与神经元内钙平衡失调有关，这种失调与神经元结构和功能失常甚至细胞死亡有直接的关系〔14〕。配体门控型离子通道的α7 nAChR对Ca2+通透性极强，对维持细胞内钙稳态具有显著作用。Ca2+流入神经细胞内与CaM相结合，进一步激活下游涉及维持LTP的级联反应〔15〕。CaM在细胞中是一种重要的多功能蛋白，40多种通道或酶被它激活，并参与许多生物学功能。CaM不仅与神经元细胞的信号级联放大系统、突触可塑性及细胞分化与增生相关，而且在LTP和学习记忆中起着显著作用〔16，17〕。

本实验成功构建了α7 nAChR mRNA真核表达载体，有效地增强了 SH-SY5Y 细胞中 α7 nAChR 的表达，为进一步的研究提供了基础。本实验结果表明，当α7 nAChR过表达时使CaM蛋白水平表达增加，可能是α7 nAChR增加使Ca2+内流，引起CaM激活，使其成为有活性的钙-钙调蛋白复合物(Ca2+/CaM)，其蛋白的表达水平能影响突触功能可塑性和神经网络的形成，导致整体认知功能的改变，减缓AD的发病进展及减少AD的发生。因此，α7 nAChR在AD的发病机制中具有重要作用，并为临床开发治疗AD的药物提供了理论参考依据。

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〔2015-12-09修回〕

(编辑 李相军)

Effect of over-expression of α7 neural nicotinic receptor gene on the expression of CaM protein in SH-SY5Y cells

ZHANG Shu-Li, LÜ Yuan-Yuan, GUAN Zhi-Zhong,etal.

The Key Laboratory of Molecular Biology, Guizhou Medical University, Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the influence of over-expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by mRNA transfection on the protein level of calmodulin (CaM)，and understand the neuroprotective mechanism of α7 nAChR and its function in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). Methods The recombinant α7 nAChR mRNA was transfected into SH-SY5Y cells, the stable clones were screened by culture medium with G418, and the levels of α7 nAChR mRNA and protein were monitored by using Real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of the CaM was also determined by Western blot.Results Cell clone strains with stable transfection of α7 nAChR mRNA recombinant plasmid was obtained. Compared with controls, the expressions of α7 nAChR mRNA and protein in such cells were increased by the synergist efficiency with 533% and 110%, respectively. The protein level of CaM was increased by 43%. Conclusions Over-expression of α7 nAChR gene resulted from the recombinant α7 nAChR mRNA can increase the level of CaM, which may affect the signal transduction pathway, which suggests that α7 nAChR may play a significant neuroprotective role in the pathogenesis of AD.

α7 nAChR；CaM；SH-SY5Y cell

国家自然科学基金资助项目(81360178)；教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)；贵州省科技厅重大专项(黔科合重大专项字2014〔6008〕)；贵州省科技厅项目(201344，黔科合SY字〔2013〕3020)

齐晓岚(1976-)，女，医学博士，教授，博士生导师，主要从事老年性痴呆发病机制研究。

张淑丽(1990-)，女，硕士，主要从事神经分子生物学研究。

R749.01

A

1005-9202(2017)06-1307-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.003

1 贵州医科大学病理学教研室