人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达

霍永旭 李 宇 刘雁军 郭元彪 杨春蕾 赵 聪

(四川大学生命科学院，四川 成都 600031)

人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达

霍永旭 李 宇1刘雁军2郭元彪3杨春蕾 赵 聪1

(四川大学生命科学院，四川 成都 600031)

目的 构建和鉴定人骨诱导因子基因(hOGN)和绿色荧光蛋白(GFP)共表达慢病毒载体，并检测其在人大肠癌细胞株HT-29中的表达水平。方法 采用PCR方法克隆hOGN基因；将hOGN基因连接到带有GFP的慢病毒表达载体pEZ-Lv201中构建慢病毒载体；将构建的慢病毒载体质粒pEZ-hOGN-SV40-eGFP-IRES-Puro(pEZ-hOGN)与慢病毒包装质粒混合物Lenti-Pac HIV mix共转染293T细胞，收集慢病毒悬液；重组病毒转染H1299细胞，定量PCR法检测重组病毒滴度；将构建的pEZ-hOGN感染HT-29细胞，荧光显微镜观察和Western印迹检测感染后HT-29细胞中GFP表达情况和目的基因hOGN的表达情况。结果 基因测序分析证实克隆的hOGN基因与GenBank提供的序列完全一致；构建的重组慢病毒载体经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定证实OGN正确插入pEZ-Lv201；定量PCR测定慢病毒滴度为0.1×109～1×109TU/ml。在HT-29细胞中重组病毒感染96 h后在荧光显微镜下可检测到较强的绿色荧光蛋白表达，Western印迹检测到在HT-29细胞中hOGN蛋白过表达。结论 成功构建携带hOGN基因的重组慢病毒载体，在HT-29细胞中有效表达。

骨诱导因子；绿色荧光蛋白；慢病毒载体；HT-29细胞

人骨诱导因子(hOGN)基因是富亮氨酸低分子蛋白聚糖家族的成员，存在于结缔组织的细胞外基质，具有多种生物学功能，如参与胞外基质的合成，胶原纤维形成的调控等〔1〕。哺乳动物中OGN参与了动脉损伤的修复与重构，因此OGN表达的增高有助于血管的重建〔2〕。近年研究显示OGN表达的改变与肿瘤的迁移、黏附、增殖有密切的相关性〔3〕，OGN可以抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的分泌〔4〕，而MMPs能够降解细胞外基质中的各种蛋白，破坏肿瘤细胞侵袭的组织屏障〔5〕，引发大肠癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞的侵袭恶化〔6〕。本研究将人全长OGN基因克隆到慢病毒质粒pEZ-Lv201上，构建重组慢病毒表达载体pEZ-hOGN，并感染人大肠癌细胞株HT-29。该慢病毒表达载体的正确构建，为建立hOGN与肿瘤相关的研究，探讨hOGN与大肠肿瘤发生发展的病理机制和基因治疗等方面奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和细胞 慢病毒表达质粒pEZ-Lv201(pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro)为本实验室保存。大肠杆菌DH5α感受态细胞购买于北京全式金生物技术公司。人大肠癌细胞株HT-29、人胚肾细胞株293T和非小细胞肺癌细胞株H1299均购买于中科院上海细胞库。

1.2 主要酶和试剂 慢病毒包装质粒试剂盒(复能基因)；Taq酶、RT试剂盒(Takara)；限制性内切酶ApaI、EcoRI、T4 DNA ligase(NEB)；1 000 bp DNA ladder marker(天根公司)；dNTP(Promega)；Plasmid抽提Kit(Qiagen)；Lipofectamine2000(Invitrogen)；胰酶(上海化学试剂公司)；RPMI1640、DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone)；兔抗OGN一抗(Abcam)；兔抗小鼠eGFP一抗、小鼠抗β-actin，小鼠抗GAPDH一抗(proteintech)；羊抗兔IgG二抗、羊抗小鼠IgG二抗(中杉金桥)；引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 hOGN基因的克隆 依据Genbank的hOGN基因的编码区(CDS)设计相应引物，根据载体质粒pEZ-Lv201的要求在引物中引入EcoRI和ApaI酶切位点。正义链：GGAATTACAAGGCTGTTAGAGAG；反义链：GGGGCCCTATTAATAACTAATGCATG(划线部分为酶切位点)，hOGN基因提取于人正常大肠组织，PCR扩增，反应条件：预变性94℃、3 min，变性94℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，30个循环，72℃延伸5 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，与Genbank提供的条带大小897 bp相符，胶回收产物保存待用。

1.3.2 重组慢病毒载体的构建、鉴定和纯化 构建和鉴定：慢病毒质粒pEZ-Lv201和目的片段分别经EcoRI和ApaI双酶切消化，用T4 DNA连接酶连接，形成含GFP基因的克隆重组体。将连接产物转化感受态细胞DH5α，扩增培养后用EcoRI和ApaI双酶切鉴定，并测序鉴定插入DNA片段的正确性。

1.3.3 重组慢病毒的包装和滴度测定 ①包装：重组慢病毒表达载体质粒pEZ-hOGN、慢病毒包装质粒复合体Lenti-Pac HIV mix与转染试剂DNA-EndoFectin complex混合后转染293T细胞。48 h后收集病毒上清，4℃下500 r/min离心10 min弃去细胞碎片，上清液用0.45 μm聚醚砜低蛋白质链接过滤器过滤收集病毒颗粒，浓缩后分装10 μl/EP管，-70℃保存。②滴度测定：24孔板接种H1299细胞2×105/孔，37℃、5%CO2孵箱中培养至细胞50%融合。慢病毒液分别以0.5、1、2、10、30 μl感染H1299细胞，72 h后荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数以计算病毒滴度。为避免误差，只选择GFP阳性细胞率为1%～30%孔进行计算，取各组平均值计算滴度。

1.3.4 转染大肠癌细胞株HT-29及其表达情况鉴定 24孔板接种HT-29细胞1×105/孔，24 h后加入预先混好的MOI=10的重组慢病毒完全培养液2 ml，37℃、5%CO2孵箱中孵育12 h后换正常培养基继续培养，72 h后在荧光显微镜观察细胞转染情况，并用Western印迹检测OGN表达情况。

2 结 果

2.1 重组慢病毒载体pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro的构建和鉴定 hOGN基因编码区DNA片段经PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳中可见897 bp特异性条带，与理论值一致(图1A)。hOGN的PCR产物纯化后与载体pEZ-lv201进行酶切，连接，转化后，得到数10个克隆，挑取4个单克隆摇菌，菌落PCR鉴定，结果显示4个克隆(克隆1，2，3，4)可扩增出897 bp的目的片段(图1B)。经测序鉴定与Genbank提供的序列一致，未发生任何突变，重组载体pEZ-hOGN构建成功。

A：1%琼脂糖凝胶电泳检测hOGN基因(897 bp有阳性条带)；B：菌落PCR鉴定克隆载体(1、2、3、4阳性克隆，5阴性克隆，PC阳性对照，NC阴性对照)图1 hOGN基因与构建的重组慢病毒载体的鉴定

2.2 重组慢病毒包装与病毒滴度测定 慢病毒包装试剂盒Lenti-PacTM HIV Expression Packaging Kit包装慢病毒载体pEZ-hOGN及其对照pEZ-eGFP后荧光显微镜下观察(图2A、2B)。包装后的慢病毒转染H1299细胞后(图2C、2D、2E)，测定慢病毒滴度约为2.12×109拷贝/ml，空载对照慢病毒浓缩后的病毒滴度约为7.9×1010拷贝/ml。

A：重组慢病毒包装后白光下的293T细胞；B：重组慢病毒包装后荧光显微镜下的293T细胞；C(1、2)：0.1 μl慢病毒载体pEZ-SV40-eGFP-IRES-Puro感染H1299细胞；D(1、2)：1 μl慢病毒载体pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299细胞；E(1、2)：10 μl 慢病毒载体pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染H1299细胞图2 重组慢病毒包装与慢病毒滴度检测

2.3 重组慢病毒感染HT-29细胞 重组慢病毒pEZ-hOGN以MOI为10感染HT-29细胞，感染后72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光，感染效率达90%以上(图3)。

A：明场慢病毒载体转染后的HT-29细胞B：荧光显下慢病毒载体转染后的HT-29细胞图3 慢病毒pEZ-hOGN感染后的HT-29细胞(×200)

2.4 Western印迹检测HT-29细胞中hOGN的表达 重组慢病毒感染HT-29细胞，72 h后收集细胞沉淀，提取细胞总蛋白，Western印迹检测细胞中OGN的表达情况，发现在36 kD左右有一条特异性条带，其大小和OGN预测条带相符合，说明包装产生的高滴度pEZ-hOGN重组慢病毒感染细胞能稳定表达OGN蛋白(图4)。

OGN：pEZ-SV40-hOGN-eGFP-IRES-Puro感染的HT-29细胞；对照组：pEZ-SV40-IRES-Puro感染的HT-29细胞图4 Western印迹检测病毒感染HT-29细胞后hOGN的表达

3 讨 论

人骨诱导因子是一类较为保守的生物蛋白，含有6 个亮氨酸富集区域，该区域是细胞黏附、信号转导、DNA 修复和RNA 加工处理的分子识别标志〔7,8〕。OGN蛋白主要分布于心室、角膜、皮肤、小肠、骨等正常组织中，是血管外基质成分之一，可以通过调节左心室肥厚度来应对外在因素的影响〔9〕，调节Ⅰ型胶原纤维的生成，在早期骨细胞中高表达刺激骨细胞的形成〔10〕，以及具在调节细胞生长和分化〔11〕的等方面有重要作用。

最近研究表明hOGN在肿瘤组织和细胞系中异常表达，并且与肿瘤的发生发展有着密切的关系，目前已发现hOGN在肝癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌〔12～14〕等恶性肿瘤中表达异常。大肠癌是世界上常见的高危害消化道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均位居前列〔15〕。细胞胞外基质环境的变化是大肠肿瘤发生的重要原因之一，而且我们前期研究也发现hOGN在大肠癌细胞中异常表达。因此，构建hOGN在大肠肿瘤细胞系中过表达的模型可以为我们研究大肠肿瘤的发病机制和探索相关分子治疗提供了有效的工具。

慢病毒载体是目前一种应用较多的目的基因重组的重要工具，其具有容纳外源性目的基因片段大，体内表达稳定，免疫反应小和安全性较好等优点〔16〕。重组的慢病毒载体可以感染非分裂细胞、分裂细胞以及多种组织。此外，pEZ-Lv201慢病毒载体属于“自杀”性慢病毒，不会利用宿主细胞形成新的病毒颗粒，病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，已成为当前重组基因研究的最佳选择。

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〔2015-10-02修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

四川省科技厅资助项目(No.14ZC1219)；成都市卫生局资助项目(No.2013089)；成都市科技厅资助项目(No.2014-HM01-00217-SF)

杨春蕾(1964-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事医学细胞生物学研究。 赵 聪(1962-)，男，教授，硕士生导师，主要从事胃肠道肿瘤研究。

霍永旭(1988-)，男，硕士，主要从事细胞生物学研究。

R34

A

1005-9202(2017)06-1332-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.012

1 成都市第三人民医院消化内科 2 成都市第三人民医院普外科

3 成都市第三人民医院实验医学研究部