莱菔硫烷对大鼠移植心脏细胞凋亡的影响

韩 燕 李占清 邬鹏宇 杨述亮 王耕野 王 帅 杨 方 郑素琴 伊 雪

(华北理工大学基础医学院病理学系，河北 唐山 063000)

莱菔硫烷对大鼠移植心脏细胞凋亡的影响

韩 燕 李占清1邬鹏宇1杨述亮1王耕野1王 帅1杨 方 郑素琴 伊 雪

(华北理工大学基础医学院病理学系，河北 唐山 063000)

目的 探讨莱菔硫烷(SFN) 预处理对大鼠心脏移植后心肌缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡的影响及可能机制。方法 健康雄性SD大鼠30只随机分成A组(假手术组，n=6)，B组(缺血再灌注组，n=12)，C组(SFN预处理组，n=12)。应用HE染色法、Western印迹法观察心肌组织学及核因子相关因子(Nrf)2、血红素加氧酶(HO)-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达水平。结果 与B组比较，C组心肌组织损伤减轻，心肌组织Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01)，并且Bcl-2/Bax也升高(P<0.01)，而Bax蛋白水平降低(P<0.01)；但与A组比较，心肌组织仍未恢复至正常；心肌组织Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax蛋白水平仍高于正常(P<0.01)，Bcl-2/Bax水平无明显变化(P>0.05)。结论 SFN可能通过激活Nrf2-ARE通路，上调Bcl-2/Bax比值，提高心肌细胞抗凋亡防御能力，对抗移植心脏冷缺血再灌注损伤。

莱菔硫烷；缺血再灌注损伤；核因子相关因子2；血红素加氧酶1；B细胞淋巴瘤/白血病-2；Bcl-2相关X蛋白

莱服硫烷(SFN)在心脏移植冷缺血再灌注损伤(IRI)中已经证实通过抗凋亡起保护作用〔1〕，但其机制尚不清楚。故本实验通过SFN预处理受体大鼠，建立大鼠心脏移植模型，观察核因子相关因子(Nrf)2、血红素加氧酶(HO)-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达，研究SFN是否通过Nrf2-ARE信号通路对抗心脏移植IRI凋亡起保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 健康雄性SD大鼠30只，体重200～220 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXX(京)2011-007。SFN (美国LKT Lab.)，兔抗Nrf2多克隆抗体(英国EterLife公司)，兔抗HO-1多克隆抗体(美国Enzo公司)，兔抗Bcl-2单克隆抗体、兔抗Bax单克隆抗体(美国Abcam公司)、抗β-actin多克隆抗体(杭州华安生物公司)。

1.2 动物分组及模型制备 按照李占清等〔1〕的方法将冷藏于4℃ HTK 液9 h的供心移植到受体大鼠腹腔，建立大鼠异体异位心脏移植模型。动物随机分为：A组(假手术组：仅行开关腹手术，术前24 h经鼠尾静脉注射等量的生理盐水，n=6)，B组(缺血再灌注组：受体于移植前24 h经鼠尾静脉注射等量的生理盐水，n=12)，C组(SFN处理组：受体于移植前24 h经尾静脉注射SFN2.5 mg/kg，n=12)。其中B组和C组移植后24 h均将移植心脏取出；A组开/关腹24 h后取自体心脏。

1.3 心肌组织学变化 10%甲醛溶液固定心肌组织、常规脱水、透明、石蜡包埋，切片，HE染色后观察心肌组织学变化。

1.4 Western印迹检测Nrf2、HO-1、Bax和Bcl-2蛋白表达 将各组适量大鼠心肌组织置入细胞裂解液中提取蛋白质，-80℃保存备用。二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量后；每孔加入50 μg蛋白样品电泳；用聚偏二氟乙烯(PVDF)转膜；依分子质量大小切取条带，取相应条带分别加入Nrf2多克隆抗体(1∶500)、HO-1多克隆抗体(1∶1 000)，β-actin多克隆抗体(1∶1 000)，Bax单克隆抗体(1∶1 000)，Bcl-2单克隆抗体(1∶1 000)4℃过夜；TBST冲洗后，分别与生物素标记的羊抗兔IgG抗(1∶1 000)室温震荡孵育2 h；TBST洗涤后，电化学发光法(ECL)显色。β-actin作为蛋白内对照参数，用Image J软件进行灰度值分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。

2 结 果

2.1 心肌组织学 A组：大鼠心肌细胞排列整齐，结构清楚，组织间隙无炎性细胞渗出，胞核清晰。B组：心肌细胞排列紊乱，大量心肌细胞水肿，心肌损坏严重。C组：心肌细胞排列较整齐，心肌损伤减轻。见图1。

2.2 Western印迹 与A组比较，B组心肌细胞Nrf2、HO-1、Bax蛋白表达增加(P<0.01)，而Bcl-2和Bcl-2/Bax表达降低(P<0.01)；与B组比较，C组Nrf2、HO-1蛋白进一步增加(P<0.01)，Bcl-2和Bcl-2/Bax 也升高(P<0.01)，而Bax 的表达降低(P<0.01))。见表1，图2。

图1 各组心肌组织的组织学变化(HE,×200)

组别Nrf2HO-1Bcl-2BaxBcl-2/BaxA组0.45±0.020.67±0.030.78±0.050.43±0.011.83±0.07B组0.92±0.051)0.91±0.021)0.59±0.011)0.90±0.021)0.65±0.011)C组1.01±0.031)2)1.05±0.031)2)1.09±0.021)2)0.61±0.011)2)1.78±0.041)

与A组比较：P<0.01；与B组比较：2)P<0.01

图2 Western印迹检测各组心肌组织Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax的表达

3 讨 论

过量的氧自由基可以直接损伤DNA诱发心肌细胞凋亡，Nrf2/ARE通路在调节氧化还原状态中发挥重要作用，通过介导下游Ⅱ相酶如HO-1等的活性，来维持机体氧化还原状态的平衡并降低氧化应激造成的损伤〔2〕。SFN可通过激活Nrf2/ARE通路，诱导下游抗氧化酶的表达，抑制氧化应激损伤，对创伤后脑损伤的神经起保护作用〔3〕。本实验结果表明SFN预处理激活了Nrf2/ARE信号通路，对移植心脏起了保护作用。

细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞死亡的最主要形式〔4〕，近年来研究发现，Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2的同源基因，功能相反。Bcl-2与Bax可共同调节细胞凋亡，与Bcl-2/Bax的比值有关，比值增大，抑制细胞凋亡，反之

则使细胞凋亡增多〔5〕。刘景诗〔6〕通过冠脉转染Nrf2腺病毒，建立心肌缺血再灌注模型，结果表明，通过激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路，上调Bcl-2/Bax的比值抑制心肌细胞凋亡保护缺血再灌注心肌。本实验结果表明心脏移植后，心肌细胞损伤严重，SFN预处理增加了Bcl-2/Bax的比值，抑制了心脏移植中冷IRI引起的心肌细胞凋亡。

1 李占清，伊 雪，邬鹏宇，等.莱菔硫烷对大鼠移植冷缺血再灌注的保护作用〔J〕.中华胸心血管外科杂志，2014;30(4)：234-7.

2 Heiss EH，Schachner D，Zimmermann K，etal.Glucose availability is a decisive factor for Nrf2-mediated gene expression〔J〕.Redox Biol，2013;1(1)：359-65.

3 Hong Y，Yall W，Chen S，etal.The role of Nrf2 signaling in the regulation of antioxidant and detoxifying enzymes after traumatic brain injury in rats and mice〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010;31(11)：1421-30.

4 吴锦波，吴平生.心肌缺血/再灌注损伤与细胞凋亡〔J〕.医学综述，2011;17(19)：2961-3.

5 Zhang H，Li Q，Li Z，etal.The protection of Bcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro〔J〕.Neurosci Res，2008;62(2)：140-6.

6 刘景诗.冠脉转染Nrf2基因对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制的研究〔D〕.长沙：中南大学，2010.

〔2015-08-24修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

留学回国人员科研启动基金(教外司留〔2010〕1561号)

伊 雪(1971-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事缺血再灌注研究。

韩 燕(1982-)，女，硕士，讲师，主要从事基础医学研究。

R965

A

1005-9202(2017)06-1335-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.013

1 华北理工大学附属医院心胸外科