甘肃牧区传统发酵乳制品中优良乳酸菌的分离筛选

邵建宁，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，彭章普，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

甘肃牧区传统发酵乳制品中优良乳酸菌的分离筛选

邵建宁，张文齐，麻和平，刘彩云，王洁，彭章普，赵昊星

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

从甘肃牧区传统发酵乳制品中分离筛选适合发酵乳生产的乳酸菌，对分离纯化的乳酸菌进行了发酵性能检测，筛选出产酸快、发酵活力高、凝乳时间短、后酸化能力弱、遗传性状稳定的菌株。筛选的6株菌株单菌发酵牛乳，均在6.5 h内凝乳，发酵乳酸度＞70°T，乳酸菌活菌数＞1×108CFU/mL，发酵乳组织状态、滋味、气味等感官指标良好，可作为生产发酵乳的优良乳酸菌菌种进行开发利用。

传统发酵乳制品；乳酸菌；分离；筛选；发酵性能

乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，是发酵乳产品产酸、产粘和产香的基础和主要原因，在发酵乳生产过程中的作用非常重要，发酵乳的品质主要是由乳酸菌作用的结果决定[1-4]。从自然环境，特别是从具有悠久历史的传统发酵乳制品中分离、筛选出优良乳酸菌种，受到了国内外研究者的广泛重视[5-8]。甘肃牧区根据地理位置分为甘南牧区和河西牧区，具有独特的地理生态环境，当地少数民族牧民沿用传统发酵方法制作发酵乳品，这些传统发酵乳制品中，蕴藏了大量未知、有待开发和利用的乳酸菌资源。本研究从甘肃牧区选取代表性的采样地点，采集传统发酵乳制品，进行产酸能力强、风味独特的优良乳酸菌分离筛选，为发酵乳工业化生产和新产品开发提供优良菌株，也为科学地开发与利用牧区传统发酵乳制品中乳酸菌资源提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

样品采自甘肃牧区牧民自制传统发酵乳，甘南牧区样品19份，河西牧区样品19份，采集的传统发酵乳样品分装于灭菌的离心管内，密封后放入冰盒，带回实验室分别于4℃和-20℃保存备用。

1.1.2 培养基

MRS肉汤培养基、M17培养基、BCG牛乳培养基：青岛海博生物技术有限公司。

脱脂乳培养基：将脱脂奶粉和水按1∶8（g∶mL）配成脱脂乳，115℃，高压蒸汽灭菌10～20 min，冷却备用。脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

1.1.3 试剂

蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉粉、大豆蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、乳糖：天津市百世化工有限公司；吐温-80：上海大众制药厂；K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3：北京化工厂。所用化学试剂为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DELTA320pH计：梅特勒-托利多（METTLERTOLEDO）集团；JA2003N电子天平：上海精密仪器有限公司；DG-1多功能培养箱：上海医疗器械修造厂；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；BH-2显微镜：日本奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分离纯化

（1）分离

取采集的传统发酵乳1 mL，和9 mL无菌生理盐水混匀，以10倍梯度稀释，选取10-4、10-5、10-6三个稀释度，各稀释度取0.2 mL分别均匀涂布于BCG牛乳营养琼脂培养基平板上，30℃平板倒置培养48 h，选择平板上菌落周围培养基变为黄色的单菌落进行保存。

（2）纯化

对分离的菌株分别在MRS培养基平板上和M17培养基平板上，划线分离纯化2～3次，同一平板划线培养后所形成的全部菌落形态一致或相似，镜检全部的细胞个体形态相似，染色反应一致，确认为纯种后，将纯化菌株接种于脱脂乳培养基中凝乳后4℃保存备用和MRS或M17液体培养基培养24 h后采用甘油法进行保藏[9]。

1.3.2 筛选

（1）初筛

将上述分离纯化得到的菌株转接到脱脂乳培养基试管中，37℃条件下培养，若脱脂乳培养基凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或球状，革兰氏染色呈阳性和过氧化氢酶试验为阴性，初步判断分离纯化出的菌株为乳酸菌[10-11]。

（2）复筛Ⅰ

将初筛得到的菌株进行发酵性能测定，包括凝乳时间、酸度、刃天青还原时间测定。

凝乳时间的测定：以肉眼观察脱脂乳培养基变黏稠，呈凝胶状，即已达到发酵终点，记录用脱脂乳培养基培养至脱脂乳凝固的时间，选择8 h内能凝乳的菌株。

酸度测定：初筛得到的菌株按5%（V/V）接种量接种于无菌脱脂乳培养基中，37℃恒温培养箱中发酵至脱脂乳凝固，采用酸碱中和法，酸度以吉尔涅尔度（°T）表示，选择酸度＞50°T的菌株。

刃天青还原实验：取l mL菌株培养液加入9 mL灭菌脱脂乳培养基试管中，再加入刃天青标准溶液l mL，将试管置于37℃水浴保温，出现淡粉红色为还原终点，选择还原终点出现时间在50 min内的菌株[12-13]。

（3）复筛Ⅱ

将复筛Ⅰ得到的菌株进行酸乳发酵，通过感官检验，筛选出风味及组织状态比较好，适宜用于生产的优良乳酸菌株。将生牛乳原料奶预热65℃，加入5%蔗糖，95℃维持5min灭菌，灭菌后立即冷却至37℃，复筛Ⅰ菌株以5%（V/V）接种量接入灭菌冷却后的牛乳中，在37℃发酵温度下进行发酵，牛乳凝固后，4℃冷藏后熟24 h。进行色泽、组织状态、滋味和气味检验。色泽和组织状态检验取适量酸奶于50 mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态。滋味和气味检验取适量酸奶于50 mL烧杯中，先闻气味，然后用温开水漱口，再品尝样品的滋味[14]。

1.3.3 分析检测

（1）活菌数测定

取1mL待测定样品，加入含9mL灭菌生理盐水的试管内，进行10倍梯度稀释，选取10-6、10-7稀释梯度，吸取0.2 mL菌悬液置于MRS或M17琼脂平板上，每个稀释梯度做3个平行，以灭菌的涂布器将菌悬液均匀涂开，然后将平板倒置于培养箱中，37℃条件下培养48 h，进行菌落计数[15-16]。

（2）pH值测定

样品pH测定，无菌取样5mL，用pH计测定样品的pH值。

（3）菌株性能检测

发酵性能检测：将筛选菌株以5%（V/V）接种量接入灭菌冷却后的牛乳中，在37℃发酵温度下进行发酵，牛乳凝固后，记录凝乳时间。4℃冷藏后熟24 h，测定发酵乳酸度、pH值及活菌数，综合发酵乳感官指标、凝乳时间、活菌数、酸度、pH值，评价筛选菌株发酵性能。

后酸化能力测定：将筛选菌株按5%（V/V）接种量接到灭菌牛奶中，在37℃条件下发酵至凝乳后，迅速放入4℃冷却保存。测定酸奶在冷藏1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d后的酸度，通过酸奶在冷藏过程酸度的增加值来判断菌株后酸化能力的强弱。

活菌保持性：将筛选菌株发酵乳，在4℃条件下贮存，测定贮存1 d、3 d、5 d、7 d、15 d样品中乳酸菌活菌数。

遗传稳定性：将复筛到的菌株，分别接种MRS或M17液体培养基中，37℃条件培下养24 h，在上述条件下连续传代5次，每代进行牛乳发酵，测定发酵乳酸度和活菌数，检验其遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离纯化

本实验从甘肃牧区采集的38份传统发酵乳制品样品中进行乳酸菌分离纯化，从BCG牛乳营养琼脂培养基平板上选择平板上菌落周围培养基变为黄色的单菌落进行保存，对分离的菌株分别在MRS培养基平板上和M17培养基平板上划线分离纯化，对菌落形态一致或相似，显微镜油镜下观察全部细胞个体形态相似，染色反应一致，确认为纯种。从MRS培养基中分离得到111株杆菌，从M17培养基中分离得到37株球菌，最终分离纯化出148株菌株。从分离纯化菌株数量分析，其中杆菌较多，球菌较少。

2.2 乳酸菌筛选

2.2.1 初筛

将分离纯化得到的菌株转接到脱脂乳培养基试管中，37℃条件下培养，挑选出脱脂乳培养基凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或球状，革兰氏染色阳性且过氧化氢酶试验为阴性的菌株，初步判断为乳酸菌，进行保藏。通过初筛得到乳酸菌96株，其中杆菌79株，球菌17株。

2.2.2 复筛Ⅰ

将初筛到的菌株在脱脂乳培养基中37℃条件下静置培养，进行凝乳时间、酸度、刃天青还原时间测定。挑选在8 h内凝乳、刃天青还原时间在50 min内，酸度＞50°T的菌株，结果见表1。由表1可知，复筛出15株发酵活力、产酸性能较好的菌株。其中菌株LQ15、XC35、OL16、OL38、ZGN14、ZGN24、XH16、SB5、SB6、SN31为杆菌，菌株SB1、SN32、LQ24、XC34、ZGN17为球菌。

表1 不同筛选菌株发酵性能测定结果Table 1 Determination results of fermentation performances of different screening strains

2.2.3 复筛Ⅱ

对复筛Ⅰ筛选的菌株进行酸乳发酵，通过感官检验，筛选出风味及组织状态比较好，适宜用于生产的优良乳酸菌菌株，结果见表2。由表2可知，乳酸球菌XC34、SB1发酵乳香味较浓，酸味适中。乳酸杆菌LQ15、XC35、ZGN14、XH16发酵乳组织状态凝乳良好、均匀细腻，酸味适中。乳酸球菌XC34、SB1和乳酸杆菌LQ15、XC35、ZGN14、XH16发酵活力较高、发酵乳组织状态及风味较好，可作发酵乳生产菌株。筛选出的6株菌株单菌发酵牛乳凝乳酸度值均＞70°T，达到了GB 19302—2010《发酵乳》中对发酵乳酸度＞70°T的要求。

表2 不同复筛菌株酸乳品质检测结果Table 2 Determination results of fermented milk quality by different secondary screening strains

2.3 筛选菌株单菌发酵性能

2.3.1 单菌产酸能力

乳酸菌的产酸特性是发酵乳生产菌种的重要指标，菌株的产酸特性直接决定酸乳的凝乳时间、风味及凝乳状态。筛选6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）以5%（V/V）接种量接入灭菌冷却后的牛乳中，在37℃温度下进行发酵，测定不同时间发酵乳酸度，结果见图1。由图1可以看出，6株菌株8 h内酸度变化都呈上升趋势，其中菌株XC35、ZGN14、XH16三株菌株变化幅度较大，说明这3株菌株发酵过程产酸能力较强，活力较好。菌株XC35、ZGN14、XH16在发酵前4 h产酸速率缓慢，酸度较低，发酵5 h后，酸度上升很快，菌株XC35、ZGN14在发酵7 h时酸度分别为83.3°T和83.8°T，菌株XH16在发酵8 h时酸度为85.8°T。结果表明，菌株XC35、ZGN14、XH16较菌株XC34、SB1、LQ15产酸能力强，产酸速度快，凝乳时间短。

图1 筛选菌株发酵酸乳在发酵过程中酸度的变化Fig.1 Changes of acidity of fermented milk by different screened strains during fermentation process

2.3.2 单菌后酸化能力

含活菌的发酵乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售过程中，虽然环境温度比较低，但是菌体仍然能够利用残存的糖类进行缓慢发酵，从而继续产生乳酸，使得发酵乳的酸度继续升高，发生后酸化现象，即发酵乳的pH值继续下降，可能因酸度偏高导致酸奶风味的变化，且酸味太重会影响消费者的口感出现过酸味及感官质量下降。低后酸化是发酵乳的一项重要指标，本实验对6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）进行了后酸化能力检测，结果见图2。

图2 筛选菌株发酵酸乳在冷藏过程中酸度得变化Fig.2 Changes of acidity of fermented milk by different screened strains during cold storage process

由图2可以看出，菌株XC35、ZGN14、XH16酸度变化较大，分别为23.1°T、19.0°T、22.0°T。菌株LQ15、XC34、SB1酸度变化分别为13.9°T、10.5°T、10.1°T，表现出弱后酸化能力。菌株XC35、ZGN14、XH16后酸化能力检测中酸度变化较大，生产应用时适合和产酸能力弱、产粘性能好的菌株复配，并应适当降低其配比比例。LQ15、XC34、SB1表现出良好的低后酸化性，在和其他乳酸菌株复配发酵酸乳时可适当提高其所占比例。

2.3.3 单菌发酵乳评价

本实验对筛选的6株菌株（XC34、SB1、LQ15、XC35、ZGN14、XH16）进行单菌发酵，将筛选菌株以5%（V/V）接种量分别接入灭菌冷却后的牛乳中，在37℃发酵温度下进行发酵，牛乳凝固后，记录凝乳时间。4℃冷藏后熟24 h，测定发酵乳酸度及活菌数，并进行感官检验，综合发酵乳感官指标、凝乳时间、活菌数、酸度，评价筛选菌株发酵性能，结果见表3。由表3可知，筛选菌株单菌株均能在6.5 h内凝乳，发酵乳组织状态较好，凝乳完整，风味较好。在4℃冷藏24 h后滴定酸度均＞70°T，活菌数＞1×108CFU/mL。其中菌株LQ15、XC35、ZGN14、XH16凝乳结实，均匀细腻。菌株XC34、SB1较黏稠，口感柔和，酸奶香味较浓。结果表明，6株菌株均适合作为发酵乳的生产菌种。

表3 单菌株发酵酸乳品质检测结果Table 3 Determination results of fermented milk quality by single strain

2.3.4 菌株遗传稳定性

将乳酸杆菌XC35、ZGN14、XH16、LQ15接种到MRS液体培养基，乳酸球菌XC34、SB1接种到M17液体培养基中，37℃条件培下养24 h，在上述条件下连续传代5次，每代菌株进行牛乳发酵，测定发酵乳酸度和活菌数，作为检验其遗传稳定性指标，结果见表4。由表4可知，实验菌株通过5次传代后，发酵乳酸度均＞70°T，活菌数＞1×108CFU/mL。在传代次数5次内的，6株筛选菌株产酸能力保持稳定，其变异系数（coefficientofvariation，CV）均＜10%。结果表明，6株筛选菌株均有良好的遗传稳定性。

表4 筛选菌株的遗传稳定性Table 4 Inheritance stability of screened strains

3 结论

从甘肃牧区采集的传统发酵乳制品中分离筛选出6株发酵性能优良乳酸菌，其中杆菌4株，球菌2株。以5%（V/V）接种量，37℃条件下单菌发酵牛乳，在6.5 h内凝乳，发酵乳酸度＞70°T，活菌数＞1×108CFU/mL，发酵乳组织状态较好，凝乳完整，风味较好，筛选的菌株具有产酸能力强、后酸化能力较弱、遗传性状稳定等优良性能，后续将进一步对其进行分子生物学鉴定，可作为发酵乳工业生产用备选菌株。

[1]张和平.自然发酵乳制品中乳酸菌的生物多样性[J].生命科学，2015，27（7）：837-846.

[2]何捷，曾小群，吕鸣春，等.新疆酸奶中高产蛋白酶与产脂肪酶乳酸菌的筛选[J].食品科学，2015，36（17）：130-133.

[3]陈芝兰，杨吉霞，李梦寒，等.西藏地区传统发酵乳中乳酸菌多样性及微生物数量分析[J].食品科学，2013，34（17）：140-145.

[4]杨吉霞，陈芝兰，杨海燕，等.牦牛奶酪中乳酸菌的分离鉴定及发酵性能分析[J].食品科学，2013，34（9）：198-204.

[5]林莹，代道芳，辛志平，等.传统培养结合分子生物学法分析传统发酵食品中乳酸菌的多样性[J].中国酿造，2011，30（2）：52-54.

[6]TAKEDA S,YAMASAKI K,TAKESHITA M,et al.The investigation of probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from traditional Mongolian dairy product[J].Anim Sci J,2011,82(4):571-579.

[7]CARAFA I,NARDIN T,LARCHER R,et al.Identification and characterization of wild lactobacilli and pediococci from spontaneously fermented Mountain Cheese[J].Food Microbiol,2015,48(6):125-132.

[8]CHAMMAS G I,SALIBA R,CORRIEU G,et al.Characterisation of lactic acid bacteria isolated from fermented milk“laban”[J].Int J Food Microbiol,2006,110(1):52-61.

[9]周德庆，徐德强.微生物学实验教程（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2013：164-166.

[10]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：353-364.

[11]凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：6-16.

[12]王蕊.开菲尔（Kefir）酸牛乳酒中乳酸菌分离及发酵性能测定[J].中国酿造，2009，28（7）：99-102.

[13]杜鹏.乳品微生物学实验技术[M].北京：中国轻工业出版社，2006：146-148.

[14]中华人民共和国卫生部.GB 19302—2010食品安全国家标准发酵乳[S].北京：中国标准出版社，2010.

[15]邵建宁，张文齐，麻和平，等.长双歧杆菌活菌制剂下游制备方法优化[J].中国酿造，2012，31（1）：99-101.

[16]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2—2010食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

Isolation and screening of excellent lactic acid bacteria from traditional fermented dairy products in Gansu pastoral area

SHAO Jianning,ZHANG Wenqi,MA Heping,LIU Caiyun,WANG Jie,PENG Zhangpu,ZHAO Haoxing
(Institute of Biology,Gansu Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

The lactic acid bacteria suitable for fermented milk production from traditional fermented dairy products in Gansu pastoral area were isolated and screened,and their fermentation performances were detected.The lactic acid bacteria screened had fast acid production rate,high fermentation activity,short curd time,weak postacidification ability and stable inheritable character.The six strains of lactic acid bacteria were screened.The fermented milks by six individual strain were all curded within 6.5 h,the acidity of fermented milk was more than 70°T,the viable counts of lactic acid bacteria were more than 1×108CFU/ml.The sensory indexes(including texture,taste,smell,etc)of fermented milk were good.The six strains could be used as excellent lactic acid bacteria for producing fermented milk to be developed and utilized.

traditional fermented dairy products;lactic acid bacteria;isolation;screening;fermentation performance

Q939.97

0254-5071（2017）03-0075-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.016

2016-11-16

甘肃省自然科学基金（1208RJZA291）；甘肃省科学院应用研究与开发项目（2013JK-03）

邵建宁（1971-），男，高级工程师，本科，主要从事生物工程应用基础研究工作。