补肺通络方对肺纤维化大鼠模型IL-4、TNF-α、TGF-β1活性表达影响的研究*

毛 毳李 佳邹 燕彭艳红

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）

·研究报告·

补肺通络方对肺纤维化大鼠模型IL-4、TNF-α、TGF-β1活性表达影响的研究*

毛 毳1李 佳2邹 燕1彭艳红1

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032）

目的研究补肺通络方对博莱霉素所致大鼠肺纤维化模型的治疗作用，以及对肺组织内IL-4、TNF-α、TGF-β1含量的影响，并初步阐释其作用机制。方法将SPF级大鼠80只随机分为4组，随机分为对照组、模型组、西药组（泼尼松）、联合组（补肺通络方+泼尼松）。采用气管切开滴入博莱霉素方法建立大鼠肺纤维化模型，15 d后开始对西药组及联合组进行灌胃治疗，观察大鼠肺组织中IL-4、TNF-α、TGF-β1的含量及肺组织病理情况。结果检测结果提示造模成功，西药组、联合组与模型组相比IL-4、TNF-α、TGF-β1含量均有统计学差异（P＜0.01）。结论补肺通络方对肺纤维化大鼠模型有显著疗效，其机制可能与下调IL-4、TNF-α、TGF-β1等因子的表达有关。

补肺通络方 肺纤维化 IL-4 TNF-α TGF-β1

特发性肺纤维化（IPF）是临床中一种以慢性炎症为主的间质性肺疾病，病因尚未有明确阐述，临床特点主要为肺部出现成纤维细胞灶，同时出现细胞外基质（ECM）的沉积，导致肺泡结构及相关肺组织呈现出慢性、进行性破坏的现象。特发性肺纤维化的病理改变难以逆转，是一种危险性极高的肺疾病［1］。由于其发病机制较为复杂，至今尚未完全明确，目前临床上对特发性肺纤维化的治疗主要使用糖皮质激素、细胞拮抗剂等［2］，但费用高，且副作用大，故寻求一种安全可靠的治疗方法尤为重要。补肺通络方为辽宁中医药大学附属医院临床自拟方，依托国家重点专科络病专科，在前期临床实践研究和文献研究的基础上进行动物实验研究［3-5］。补肺通络方具有平补阴阳，理肺通络的功效。为探讨其作用机制，本课题组选择IL-4、TNF-α及TGF-β1作为检测指标研究补肺通络方对肺纤维化的防治作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取SPF级大鼠80只，雌雄各40只，体质量（200±20）g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK辽2010-0001。

1.2 试药与仪器 补肺通络方中药煎剂，组方：黄芪20 g，人参12 g，补骨脂12 g，当归12 g，川芎12 g，半夏12 g，海藻12 g，钩藤6 g，鸡血藤12 g（所用药物由辽宁中医药大学附属医院提供），药材加水1000 mL浸泡30 min后煮沸30 min滤过取汁，再加水1000 mL煮30 min滤过取汁，合并2次药液，水浴浓缩成含药1 g/mL的药液，高压灭菌后分装，4℃冰箱保存备用。博莱霉素（zeocin）（日本化药株式会社高崎工厂，H20090885）；泼尼松片 （天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020123）；10%水合氯醛；PBS缓冲液（pH=7.4）；IL-4试剂盒（美国bender，BMS613）、TNF-α试剂盒（上海博迈生物科技有限公司，96T）、TGF-β1试剂盒 （上海中乔新舟生物科技有限公司，96 tests）。匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司，DY89-II）；酶标仪（上海永创医疗器械有限公司，SM800）；离心机（上海赵迪生物科技有限公司，GL-25MS）；培养箱（上海森信实验仪器有限公司，DRP-9052）。

1.3 分组与造模 造模分组前将实验大鼠于实验室内适应性喂养2 d（实验室温度控制在23~25℃；湿度控制在50%~60%），适应性喂养后观察大鼠一般情况，确保实验前大鼠的状态良好，然后进行分组。采用简单随机数字表法，将大鼠分为对照组、模型组、西药组（泼尼松）、联合组（泼尼松联合补肺通络方），每组20只，雌雄不限，分开饲养。对照组不进行造模。其余3组于正式实验第1天进行造模，选用10%水合氯醛（4 mL/kg），经腹腔注射将3组实验鼠进行麻醉，大鼠麻醉后将博莱霉素（5 mL/kg）一次性注入大鼠气管，形成大鼠肺纤维化模型，期间注意观察大鼠生理状态，于实验第15天，完成大鼠肺间质纤维化造模。

1.4 给药方法 依照体表面积公式［6］，参照人的体质量给药量，计算出大鼠每天体质量的给药量，在实验第16天起，西药组大鼠给予泼尼松（3 mL/kg）和生理盐水的混合制剂（5 mL/kg）灌胃，联合组大鼠用中药煎剂（5 mL/kg）+泼尼松混合制剂 （3 mL/kg）灌胃，每天1次。在此期间对照组、模型组正常饲养。

1.5 标本采集与检测 实验进行至30 d，给药结束后，限制大鼠进食不限制饮水，保证第31天取材时空腹时间8 h。实验进行至31 d进行取材；麻醉采用10%水合氯醛腹腔注射；麻醉成功后于大鼠腹主动脉取血留存；摘取大鼠双侧肺叶，切取400~500 mg大鼠左肺下叶于冰浴条件下制备肺组织匀浆，并在4℃、3000 r/min条件下进行离心，时间为20 min，抽取上清液，送往生化实验室检测。TGF-β1、IL-12和TNF-α的含量采用ELISA方法检测。大鼠右肺上叶用于做病理检测，将右肺上叶采用10%甲醛进行固定，而后进行石蜡包埋切片的制备，而后染色观察。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计分析软件，计量资料以（s）表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。另外在数据符合正态分布时采用方差分析；在数据为非正态分布时采用秩和检验后，进行组间的非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 对照组大鼠状态良好，体态正常，活动灵活，皮毛光亮，无脱毛，眼耳口鼻无异常分泌物，颜色淡红；呼吸、饮食、排泄正常，无异常死亡；模型组大鼠消瘦明显，行动缓慢，皮毛颜色暗淡无光泽，口鼻存在少量分泌物，口唇、耳、鼻色偏暗红，饮食较少，大便不成形甚至出现稀溏现象，部分大鼠出现喘息气促，但无异常死亡；西药组大鼠体态偏瘦，活动量减少，皮毛色暗无光泽，口、鼻、耳分泌物量少，色暗红，饮食偏少，出现大便稀溏现象，但无异常死亡；联合组大鼠体态接近正常，但个别略瘦，皮毛光泽度欠佳，口、鼻、耳无异常分泌物，口唇色红，饮食正常，大便正常但量稍多，质地黏稠，无异常死亡。

2.2 肺组织形态学变化 （外观检查） 对照组两肺叶表面光滑，色泽粉红明润，饱满；模型组表面凸凹不平，为暗红色，肺叶成灰白色，表面有灰白色斑点，边缘有点状出血点；西药组、联合组部分肺叶表面光滑，部分呈暗红色。

2.3 肺组织形态学变化（光镜检查）

2.3.1 HE染色 见图1。对照组支气管腔内整洁，外壁间质狭窄，肺泡壁薄，肺泡皱壁、内膜完整；模型组支气管管腔存在脱落的黏膜上皮，外壁间质明显增厚，局限性肌层增厚，肺泡壁大部分增厚，肺泡结构破坏，肺实质结构紊乱，局部炎细胞浸润，西药组、联合组支气管黏膜完整，肺泡壁大多较薄，支气管壁轻度增厚或增厚不明显，大多数肺泡壁较薄或增厚不明显。

图1 光镜肺组织形态学变化（HE染色，20倍）

2.3.2 Masson染色 见图2。对照组可见支气管壁及血管壁内存在少量的胶原纤维，而肺泡壁和肺间质内大部分则为肌纤维组织；模型组可见支气管壁、血管壁、肺泡壁及肺间质大量胶原纤维明显增生，以大量的蓝绿色胶原沉积模式为主，表现为灶性纤维形成，肺纤维化多为中重度。西药组、联合组支气管壁、血管壁、肺泡壁及肺间质仅存在少量的胶原纤维增生，纤维化程度远较模型组减轻。

图2 光镜肺组织形态学变化（Masson染色，20倍）

2.4 各组大鼠肺组织匀浆中IL-4、TGF-β1、TNF-α表达水平比较 见表2。模型组肺组织中TNF-α、TGF-β1及IL-4表达明显高于对照组（均P＜0.01），说明模型组TNF-α、TGF-β1、IL-4增高属于异常的病理状态。治疗后，西药组及联合组的大鼠肺组织匀浆中TNF-α、TGF-β1及IL-4表达均低于模型组，均有显著差异（均P＜0.01）；联合组TNF-α、TGF-β1及IL-4表达低于西药组，差异具有显著统计学意义（均P＜0.01）。故可认为补肺通络汤可以明显抑制大鼠肺组织中TNF-α、TGF-β1及IL-4的表达，从而延缓纤维化的进程。

表2 各组大鼠肺组织匀浆中IL-4、TGF-β1、TNF-α表达水平比较（ng/L，s）

表2 各组大鼠肺组织匀浆中IL-4、TGF-β1、TNF-α表达水平比较（ng/L，s）

与对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与西药组比较，▲P＜0.01。

组别 n 大鼠T N F -α（n g / L）I L -4（n g / L） T G F -β 1（n g / L）对照组 2 0 2 0 3 . 6 7 ± 2 . 6 7 1模型组 2 0 2 7 0 . 6 6 ± 2 . 3 0 3*西药组 2 0 2 4 0 . 3 8 ± 1 . 9 8 9△4 . 7 8 ± 1 . 3 6 7 2 6 . 4 7 ± 1 2 . 8 9 7 . 8 2 ± 1 . 7 8 6*1 1 0 . 8 9 ± 1 8 . 8 9*6 . 5 6 ± 2 . 0 8 9△8 9 . 3 7 ± 1 7 . 4 8△联合组 2 0 2 2 0 . 4 5 ± 1 . 6 7 6△▲5 . 6 8 ± 1 . 5 8 9△▲4 7 . 8 9 ± 1 8 . 9 0△▲

3 讨 论

肺纤维化在临床中早期特点是出现肺泡炎症，中晚期特点是肺出现纤维化，属于一种慢性进行性的复杂性疾病［7］。中医亦无特定病名归属，大多数学者则根据肺纤维的发病特点、临床表现、及病变趋势等方面，将其划分为中医学 “肺痿”“肺痹”“肺胀”“咳喘”等范畴，其病位在肺，与脾肾两脏相关密切，病机为本虚标实，即以肺气亏虚为本，痰瘀互结阻于络脉为标，故肺纤维化的治疗关键在于平补肺气，化痰祛瘀通络，使气虚得以纠正，脏腑气机运行通畅，气行则血行，肺宣发肃降权衡，通调水道规律，则痰瘀渐化，气血津液运行恢复至正常，则临床症状逐步好转［8-9］。本实验旨在研究补肺通络方对肺纤维化的治疗作用以及作用机制，纵观全方，黄芪、人参补益肺脾，益气活血；补骨脂补益肺肾，温阳纳气；当归、川芎辛香走窜，养血行血；半夏、海藻祛湿化痰，通畅肺气；钩藤、鸡血藤通补肺气、荣养肺络。诸药合用，肺吸入清气摄纳有节，气血津液输布正常，痰浊瘀血归于正化，肺络通畅，肺之气血循脉络流注不已，则肺体自安。现代药理学认为［10］，人参总皂苷具有抗氧化损伤的作用，能够保护纤维化的肺脏；黄芪多糖能够调节细胞因子Th1/Th2的平衡及NO代谢，提高机体抗氧化能力；当归多糖能够改善肺功能和肺系数；川芎能够改善机体自由基损伤，提高肺功能；异钩藤碱能够在肺动脉高压及PASMCs增殖的作用下起到对肺部的保护作用。

近年来，特发性纤维化的发病机制一直是研究的重点，TH1/TH2细胞因子失衡学说［11-12］更是成为肺纤维化发病机制的研究热点，因此笔者选取TH2型细胞因子IL-4、TNF-α及TGF-β1作为观测肺纤维化治疗程度的指标。TGF-β1是导致纤维化的机制成为近年来研究重点［13］，普遍认为TGF-β1主要是通过介导肺泡炎症、损伤以及促进细胞外基质的沉积两种作用途径，诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，最终导致纤维化的形成。IL-4作为一种促纤维化细胞因子，主要通过促进B细胞的增殖、促进CD4+T细胞向Th2细胞分化和Th2细胞增殖以及产生炎性介质3种作用途径直接刺激成纤维细胞的趋化、增殖和分化，促进胶原、纤连蛋白及细胞粘合素的合成［14］，促进肺组织纤维化。TNF-α在肺纤维化形成中发挥着重要。Sullivan的研究发现，在博莱霉素致纤维化的大鼠模型中，TNF-α通过启动TNFRI、TNFRZ信号传导，诱导TGF-β的表达，从而促进胶原合成和成纤维细胞增殖，从而确定TNF-α的促纤维化作用［15］。黄成亮［16］经临床实验证实，丹参联合川芎可以通过可能与减少血清TGF-β1和TNF-α的含量，从而起到防治肺纤维化的目的。TGF-β1、IL-4、TNF-α均是导致纤维化的发病过程的主要细胞因子［17-19］，故被选为本实验研究的效应指标，通过应用补肺通络方治疗本病，观察3组指标的变化并解释其作用机制。结果比较3组数据，模型组肺组织中，TGF-β1、IL-4、TNF-α的表达水平高于正常，说明高表达的3种指标属于本病的一种病例状态；治疗后，西药组以及联合组的大鼠肺组织匀浆中，TGF-β1、IL-4、TNF-α表达均低于模型组，均有显著性差异，证明无论是西药组或是联合组均可以降低TGF-β1、IL-4、TNF-α的水平，即均对特发性肺纤维化有治疗作用；最后西药组与联合组进行组间比较：联合组的大鼠肺组织匀浆中TGF-β1、IL-4、TNF-α表达均明显低于西药组，两组结果具有显著统计学差异（P＜0.01），证明联合组的治疗作用明显优于西药组，由此可以确定补肺通络汤对特发性纤维化的治疗作用。综上所述，补肺通络方能够明显降低TGF-β1、IL-4、TNF-α在肺组织匀浆的表达，从而起到防治肺纤维化的作用，且结果优于单纯使用西药泼尼松。

本研究基于肺纤维化的西医发病机制以及中医致病特点，在传统经方“补肺汤”的基础上加减，自拟补肺通络方，经大鼠动物实验证实，补肺通络方可以明显降低IL-12、TNF-α和TGF-β 3种指标在肺组织中的表达，从而起到抑制成纤维细胞在肺部的增殖，同时降低胶原的合成，达到减缓本病发病的进程的目的，为中医学治疗肺纤维化提供新的思路。

［1］ King TJ，Pardo A，Selman M.Idiopathic pulmonary fibrosis［J］. Lancet，2011，378（9807）：1949-1961.

［2］ Hauber HP，Blaukovitsch M.Current and future treatment options in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Inflame Allergy Drug Targets，2010，9（3）：158-172.

［3］ 姚明，王祺，于雪峰.中药复方治疗肺纤维化文献分析［J］.辽宁中医药大学学报，2012，14（5）：116-118.

［4］ 滑振，吕晓东，庞立健，等.基于现代文献的肺纤维化中医证候及证素特征数据挖掘［J］.世界中西医结合杂志，2015，10（9）：1188-1121.

［5］ 任延毅，吕晓东，庞立健，等.补虚通络疗法治疗特发性肺纤维化的预后分析［J］.2016，31（5）：1959-1962.

［6］ 徐叔云，卞如濂，陈修.《药理实验方法学》第2版出版发行［J］.中国药理学通报，1992，1：19.

［7］ 李瑶，刘新桥.中医药治疗肺纤维化研究进展［J］.中医学报，2015，30（3）：340.

［8］ 黄云鉴，龚婕宁.肺纤维化的中医病名、病机及证治规律探析［J］.辽宁中医药大学学报，2016，18（7）：239-241.

［9］ 韩素恒，刘妮波，郝彧，等.中医药治疗特发性肺纤维化的文献计量学分析［J］.中医药导报，2016，22（13）：64-67.

［10］汪骏，曾锦波，王世鑫.中药防治肺纤维化的药理学研究进展［J］.武警医学院学报，2005，14（6）：489-492.

［11］张晓猛，刘超，夏光云.Th1/Th2型细胞因子在小鼠肺纤维化发病中的作用［J］.蚌埠医学院学报，2013，38（8）：932-934.

［12］庄谊，张德平.肺纤维化与Th1/Th2失衡［J］.国外医学：呼吸系统分册，2005，25（5）：349-351.

［13］Postelthwaite AE，Holness MA，Katai H，et al.Human fibroblasts synthesize elevated levels of extracellular matrix proteins in response to interleukin 4［J］.J Clin Invest，1992，90（4）：1479-1485.

［14］Postlethewaite AE，Seyer JM.Fibroblast chemotaxis induced by human recombinant interleukin-4：identification by synthetic peptide analysis of two chemotaxic domains residing in amino acid sequences 70-88 and 89-122［J］.J Clin Invest，1991（6）：2147-2152.

［15］Sullivan DE，Feris M，Pociask D，et al.Tumor necrosis factoralpha induces transforming growth factor-betal expression in lung fibroblasts through the extracellular signal-regulated kinase pathway［J］.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology，2005，32（4）：342-349.

［16］黄成亮，李艳艳，范贤明，等.丹参联合川芎嗪对肺纤维化大鼠血清、支气管肺泡灌洗液中TNF-α和TGF-β1水平的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（7）：673-676.

［17］隋君娜，张华，牟晓峰，等.TNF-α在矽肺纤维化发病机制中的作用研究［J］.工业卫生与职业病，2015，41（5）：389-393.

［18］常晓龙，王明臣，刘雪，等.盐酸氨溴索在放射性肺损伤中的保护作用及对血浆TGF-β1和TNF-α水平的影响［J］.广州医药，2015，46（1）：8-10.

［19］江柏华，李晓燕，张碧海，等.丹贝益肺方对肺纤维化大鼠血清IL-4、INF-γ水平的影响［J］.中国中医药科技，2015，22（5）：498-499.

Study on the Effect of Bufei Tongluo Decoction on the Expression of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in the Rat Model of Pulmonary Fibrosis

MAO Cui，LI Jia，ZOU Yan，et al. Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

Objective：To research on the therapeutic effect and influence of Bufei Tongluo decoction on the content of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in lung tissue on pulmonary fibrosis rat model caused by zeocin and interpretate its mechanism.Methods：The SPF 80 rats were randomly divided into 4 groups，respectively group A（control group），group B（model group），group C（prednisone treatment group），group D（Bufei Tongluo decoction+prednisone treatment group）.Pulmonary fibrosis model was set up by tracheotomy driping zeocin.After 15 days，lavage treatment was applied to group C and group D.The content of IL-4，TNF-α，TGF-β1 in rat lung tissue and lung tissue pathology were observed.Results：Test result suggested model building success.Compared with model group，IL-4，TNF-α，TGF-β1 of prednisone treatment group，Bufei Tongluo decoction+prednisone treatment group had statistical significance（P＜0.05）.Conclusion：Bufei Tongluo decoction has significant curative effect on pulmonary fibrosis in rat model，the mechanism may be related to downgrade of IL-4，TNF-α，TGF-β1.

Bufei Tongluo decoction；Pulmonary fibrosis；IL-4；TNF-α；TGF-β1

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0397-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.007

2016-08-09）

辽宁省临床能力建设项目（LNCCC-C04-2015）