淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料制备及特性研究*

张传志 曹洪辉 周 庾 胡晓波 卢卫忠 张太君

（重庆市中医院，重庆 400021）

·研究报告·

淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料制备及特性研究*

张传志 曹洪辉 周 庾 胡晓波 卢卫忠 张太君

（重庆市中医院，重庆 400021）

目的构建淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料，观察材料特征和装载的淫羊藿苷、TGF-β1释放情况。方法利用乳化交联技术构建PRP微球，原位复合+冷冻干燥技术构建淫羊藿苷/羟基磷灰石支架，二者复合构建淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA），观察其物理特性；利用ELISA法测定TGF-β1体外释放，利用液相光谱仪测定淫羊藿苷体外释放。结果淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料体外TGF-β1、淫羊藿苷释放均接近3周，植入/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料的骨缺损骨修复良好。结论EP/PRP/CS/HA复合材料能够实现生长因子和淫羊藿苷的长程作用，有望成为一种骨缺损修复材料的方法。

淫羊藿苷 富血小板血浆 生长因子 骨修复

骨缺损指骨的结构完整性被破坏，创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因［1］。尽管骨折治疗的方式与方法有较大的进步，但是骨缺损的发生率仍然较高。骨缺损是临床治疗中的一个难题和挑战［2］，给患者及社会带到沉重精神负担和医疗负担。促进骨缺损修复对缩短临床治疗时间和保留患者肢体功能，避免和减少劳动力丧失，降低医疗费用等均具有重要意义。研究表明富血小板血浆（PRP）、淫羊藿苷能够促进骨修复，但骨折愈合过程较长，上述物质的长时间作用更利于骨修复重建。如果通过构建壳聚糖富血小板血浆载药微球和淫羊藿苷羟基磷灰石支架，同时实现生长因子和中药淫羊藿长程缓放释放，可能更有效影响骨修复的过程。本实验基于上述设想，通过构建淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA），并观察该材料中淫羊藿和TGF-β1（PRP活化后众多影响骨修复的生长因子之一）能否实现长时间释放。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性新西兰大白兔，新桥医院动物中心提供。

1.2 仪器与试剂 冷冻干燥机，北京博医康FD-1A-80；恒温震荡机，万合仪器THZ-D；万能试验机，上海企想检测仪器有限公司；XDS-200C X线机，北京岛津医疗有限公式BR-120M；羟基磷灰石，Amresco（上海信裕生物科技有限公司）；壳聚糖，MERCK MILLIPORE（上海钰博生物科技有限公司）；淫羊藿苷，Amresco（上海信裕生物科技有限公司）；乙酸（重庆齐星化工）；2%NaOH（重庆齐星化工）；无水酒精（重庆齐星化工）；水合氯醛（重庆齐星化工）；Span80（天津市光复精细化工有限公司）；异丙醇（重庆齐星化工）；无水乙醚（重庆齐星化工）；EDTA（重庆齐星化工）；Elisa兔TGF-β1检测试剂盒（上海彩佑生物发展有限公司）。

1.3 构建方法 1）淫羊藿苷/壳聚糖/羟基磷灰石复合材料构建（EP/CS/HA）［3］。精确称量HA、CS（HA∶CS质量比为5∶5）的粉体后，放入盛有淫羊藿溶液（淫羊藿的质量占总质量的10%）的烧杯中，加入一定量蒸馏水，使有机相浓度介于10%（W/V）之间，再加入一定量的乙酸溶液，使CS充分溶解。将该混合物于40℃水浴中充分搅拌成乳液状后，超声波处理消除气泡。将此乳液倾入金属模具（4 mm×15 mm），在4℃的冰箱中冷藏过夜，然后分别在-20℃、-80℃下预冷冻48 h后，真空冷冻干燥48 h，得EP/CS/HA复合支架材料。用含2% NaOH的乙醇浸泡2 h中和乙酸，蒸馏水冲洗，二次冷冻干燥后备用。所有支架材料均采用20 kGy60Co辐照灭菌消毒标记备用。2）淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA）构建。新西兰大白兔采用水合氯醛腹腔注射的方法进行麻醉（10%，400 mg体质量）。先给予总量的2/3，根据麻醉效果追加麻药。麻醉成功后兔取俯卧位，四肢绑缚固定。备皮消毒，从兔耳中央动脉抽取5 mL血，装在预先放有0.5 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的10 mL离心管中，参照文献［4］方法进行PRP提取：将新鲜血分2次离心，第1次200×g离心10 min，吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至另一离心管，平衡后再次200×g离心10 min，此时离心管中液体分为两层，吸取约3/4上清液弃掉，摇匀剩余液体，即为PRP（约0.5 mL），摇匀，备用。将壳聚糖溶于5%的醋酸溶液中，得到3%的壳聚糖溶液；PRP加入3%的壳聚糖溶液10 mL中并充分搅拌（体积比1∶1），制成壳聚糖/PRP混合液。在500 mL烧杯中加入100 mL无菌液体石蜡，1 mL Span80，一定速度磁搅拌下逐滴加入壳聚糖/PRP混合液10 mL，使水油比达到1∶10，常温下搅拌，乳化15 min。反应完成用3号砂芯漏斗真空抽滤，用异丙醇、无水乙醚反复冲洗，静置备用［5］。制作过程严格无菌操作。将富血小板血浆微球（CS-PRP）置入一定量PBS缓冲液中，淹没EP/CS/HA复合支架材料，恒温匀速震荡1 h备用，干燥备用。3）淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA）力学、形态学检测。将材料摄片，并用万能试验机进行力学检测。4）淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/ HA）淫羊藿苷体外释放［3］。将Ep-PRP-CS/HA材料放入盛有5 mL PBS（pH7.4）的密闭玻璃离心管中，37℃恒温低速振荡，分别于1，2，3，4，5，6，7，14，21 d定时收集全部溶液，4℃避光储存待检，补足等体积的PBS。将上述提取液离心，取0.5 mL上清于另一离心管中，加入0.5 mL的乙腈，15000 r/min离心10 min，取上清20 μL过膜，高效液相色谱仪（杭州海普科技有限公司赛尔泰Syltech500型高效液相色谱仪，检测波长270 nm）检测并记录峰面积积分值，根据标准曲线换算出每次测量的药物释药量（表2），并得出累计释放量，得出累积释放药物占总载药量百分率并绘制曲线。5）淫羊藿苷/富血小板血浆微球/羟基磷灰石复合材料（EP/PRP/CS/HA）TGF-β1体外释放。将材料小心碾碎后加入含1 mL PBS液的EP管中，37℃摇床震荡，10000 r/min离心10 min，收集全部上清液标记，4℃备用，ELISA法测定上述液体中TGF-β1量，沉淀物再次加入等量PBS液，继续震荡。依法测量1，2，3，4，7，14，21，60，90 d时间点材料提取液中TGF-β1并记录分析。

2 结 果

2.1 材料结果 见图1。可见材料为多孔均质网状结构。EP/PRP/CS/HA复合材料力学性能方面，断裂强度为（1.1±0.3）MPa，弹性模量为（26±5.1）kPa。

图1 支架照片

2.2 EP/PRP/CS/HA复合材料的淫羊藿苷释放时间见表1、图2。测定第1周每天、第2周末、第3周末提取液中淫羊藿苷上样检测峰面积，换算出每次测样淫羊藿苷含量和累积含量，可以看出EP/PRP/CS/HA复合材料到第3周仍有淫羊藿苷释放，而前3 d到达了36%，表明该支架材料仍存在一定程度药物突释，之后释放量相对稳定，第2周末、第3周末有超过10%的释放，60 d、90 d仍有少量释放。

2.3 EP/PRP/CS/HA复合材料TGF-β1体外释放时间

见表2、图3。第1周释放较快，其中前3 d到达61%，其后释放较为缓慢，第2、3周仍有释放，释放量约占1.54%、1.30%。

表1 EP/PRP/CS/HA复合材料的淫羊藿苷释放时间

图2 EP/PRP/CS/HA复合材料的淫羊苷藿释放时间

表2 EP/PRP/CS/HA复合材料TGF-β1体外释放时间

图3 EP/PRP/CS/HA复合材料TGF-β1体外释放时间

3 讨 论

骨缺损在临床诊疗中常常面临可供骨移植材料不够、患处成骨能力下降的困境，如何在提供有效的，容易获得的骨移植材料并提高成骨能力是所有医务人员面临的难题。由于骨缺损的修复需要有移植材料相容性同时具有骨传导性、骨诱导性及骨祖细胞，如果一种移植复合物结合了全部3种骨再生所需要的成分，可望为骨缺损治疗带来莫大好处。目前，传统吻合血管的自体/异体骨移植、人工合成替代物移植等多种方法成为临床常用的骨缺损修复技术［6］。但是这些方法应用过程中存在重要缺限，如易出现并发症的供骨区、有限的供体来源、而无活性的异体骨虽然不受数量的限制，却存在排异和传染疾病的可能。近年来，骨组织工程技术的实验研究给骨缺损的治疗带来无限发展前景。这些组织工程技术包括多种生物元素，如骨传导性支架、缓释诱导成骨生长因子、负载具有成骨潜能的细胞以及组织工程骨血管化或充足的血供等［7-11］。可见，组织工程技术成为修复骨缺损的趋势，积极开发与研究不同因素的治疗技术成为骨缺损治疗的重要内容。

淫羊藿又名仙灵脾，是小檗科植物，为传统补益中药，辛温，无毒，坚筋骨，益精气，补腰膝，强心力。研究发现，淫羊藿可以有效影响兔颌骨骨缺损的愈合时期［12］，对成骨细胞调亡的影响有明显作用［13］，可以有效影响干预人工关节磨损微粒诱导的骨溶解现象［14］。说明中药淫羊藿苷能有效影响骨代谢、骨修复过程。为实现淫羊藿的长时间作用，不少研究者尝试不同方法探讨实现药物缓释的可行性。席与斌等［15］利用二氯甲烷溶解淫羊藿苷，与大豆磷脂、胆固醇共同构建脂质体，证实可以实现淫羊藿苷的长程释放，但72 h释放量到达81%，且存在二氯甲烷残留毒性问题；李群芳等［16］构建载CaCO3微球并实现18 h的释放，而骨折愈合时间往往更长，数周至数月不等，探索新的载药方式具有较大意义，研究表明，EP-PRP-CS/HA材料能够至少实现3周的淫羊藿苷释放，且2、3周仍有较为平稳的释放，分别可到达13.70%，11.80%。骨折后修复过程需要经历肉芽组织修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期、塑形期，其中肉芽组织修复期中通过肉芽组织实现骨折的初步连接，在成人约需2~3周，是骨折修复开始的关键时期。研究表明EP-PRP-CS/HA材料能够提供2~3周较为稳定的淫羊藿苷释放，提示该方法可能对促进骨折修复重建有较为重要意义。

生长因子对成骨细胞分化增殖有重要调节作用，如BMP、TGF-β、bFGF、IGF、PDGF等，但多为单一生长因子作用观察［17-18］，部分研究［19］尝试联合两种以上生长因子进行研究，均证实生长因子不同程度上促进了骨修复。但是，体内骨修复过程中多种生长因子序贯、长程作用却成为当前认为是促进骨修复的关键因素。因此，如何改变当前的单一生长因子的作用，实现生长因子长时间，模仿机体内生长因子作用模式仍是组织工程困难所在，亦是目前组织工程研究热点和难点。富含血小板血浆（PRP）是自体源性、浓缩的含血小板的血浆，是全血经过分离而得到的血小板浓缩物。在PRP形成富含血小板凝胶（PRG）的过程中，血小板通过脱颗粒作用释放血小板源性生长因子、转化生长因子β1、转化生长因子β2、IGF、表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子等，其浓度约为体内正常浓度的3~ 8倍。因此，研究人员［19］尝试将PRP复合到各种支架载体上探讨骨修复可行性，取得一定成果。钟达［20］将PRP和支架复合后证实成骨效应类似自体髂骨，许永伟等［21］利用壳聚糖制备PRP载药微球，证实至少3周的TGF-β1释放，第1周释放量较大，第2、3周释放量较小、稳定，和本研究结果类似。因为生长因子性质相对不稳定，往往只能通过高浓度浸泡材料来实现载药，本研究尝试利用微球对其进行包裹，实现了3周左右的释放，但仍然存在一定的问题：虽然利用ELISA方法测定了TGF-β1含量，但实验中的化学物质对生长因子活性影响尚需进一步研究。

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Co nstruction and Characterization Study of Combined Graft （Epimedium-chitosan-hydroxyapatite Loaded with Platelet Rich Plasma Microspheres）

ZHANG Chuanzhi，CAO Honghui，ZHOU Yu，et al. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China.

Objective：To prepare combine graft（Epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with Platelet Rich Plasma microspheres EP/CS/PRP/HA）and observe their characteristics and release behavior in vitro of Epimedium and transforming growth factor-beta1（TGF-β1）.Methods：Platelet Rich Plasma chitosan microspheres were prepared by emulsion cross-linking method and scaffold of epimedium-chitosan-hydroxyapatite（EP/CS/HA）was built by in-situ hybridization and cryogenic freeze drying technology，the Platelet Rich Plasma microspheres were soaked in EP/CS/HA and their characteristics were observed and release behavior in vitro of Epimedium was detected by ultra-performance liquid chromatography（UPLC）and transforming growth factor-beta1（TGF-β1）was detected by Elisa.Results：The combine graft（EP/CS/PRP/HA）presented a homogeneous porous form and had long time release of Epimedium and TGF-β1.Conclusion：The combined graft（EP/CS/PRP/HA）can achieve long time release of Epimedium and TGF-β1 and might be a promising reconstruction material for bone defect treatment.It is expected to be a possible method in bone defect treatment as it shows enhanced bone repairing.

Epimedium；Platelet-rich plasma（PRP）；Growth factor；Bone repair

Q95

A

1004-745X（2017）03-0390-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.005

2016-11-14）

重庆市卫计委面上项目基金资助（2013-2-089）