清肝滋肾中药对高脂喂养自发性高血压大鼠肝脏组织Sirt1蛋白表达的影响*

占美锦张箫箫殷晓威严 羽任炜炜蒋卫民

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

·研究报告·

清肝滋肾中药对高脂喂养自发性高血压大鼠肝脏组织Sirt1蛋白表达的影响*

占美锦1张箫箫1殷晓威1严 羽1任炜炜1蒋卫民2△

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

目的观察清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）对高脂喂养的自发性高血压（SHR）大鼠肝脏组织Sirt1蛋白表达及肝细胞脂肪浸润的影响。方法18只4周龄雄性SHR大鼠，随机分为正常饮食对照组（普通饲料+安慰剂）、高脂饮食模型组（高脂饲料+安慰剂）及清肝滋肾中药组（高脂饲料+针箭颗粒Ⅱ号），每组大鼠均为6只，干预8周后取各组大鼠肝脏组织，采用Western blotting法检测Sirt1及其裂解酶Caspase1蛋白的表达，并分别进行HE染色、油红O染色观察肝脏细胞脂肪浸润情况。结果与正常饮食对照组相比，高脂饮食模型组Sirt1蛋白表达降低，Caspase1表达水平显著增高 （P＜0.001）；与高脂饮食模型组相比，清肝滋肾中药组Sirt1蛋白表达水平升高，Caspase1表达水平明显下降（P＜0.05）。HE染色及油红O染色显示高脂饲料喂养导致肝脏组织结构紊乱，大量脂肪浸润，清肝滋肾中药组脂滴密度和大小较高脂模型组均有显著降低。结论清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）能显著上调高脂喂养SHR大鼠肝脏组织Sirt1蛋白的表达，显著减轻SHR大鼠的肝脏脂肪浸润，从而在改善高血压相关代谢障碍中发挥重要作用。

高血压 高脂 清肝滋肾 Sirt1

高血压是一种以动脉血压持续升高为特征的进行性“心血管综合征”。随着社会经济的发展，人们生活方式及饮食结构改变，临床中高血压合并不同程度、形式的代谢紊乱越来越常见，带来的心脑血管疾病风险也明显增高［1-3］，但其发生机制还不十分明确。Sirt1是一种NAD+依赖的组蛋白脱乙酰基蛋白酶，研究表明，它能参与体内众多蛋白酶和转录因子的活性调节，发挥改善胰岛素抵抗，调节糖脂代谢，干预代谢紊乱的作用［4-5］。Caspase1作为一类蛋白裂解酶能在高脂饮食等诱发的炎症发应过程中被激活，并通过选择性剪切Sirtl，使Sirt1表达下调［6-7］。清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）的前期研究已证实在稳定血压的同时，具有改善胰岛素抵抗、糖脂异常等高血压相关代谢紊乱的作用［8-9］。本实验通过观察其对高脂诱导SHR大鼠肝脏组织Sirt1蛋白表达及脂肪浸润的影响来探讨清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）改善高脂诱导的SHR大鼠代谢紊乱的作用机制，为临床进一步拓展其应用提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 18只4周龄雄性SHR大鼠，体质量（102.50±5.54）g，购自北京维通利华公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物与试剂 大鼠普通饲料由南京中医药大学GLP中心提供，高脂饲料 （Rodent diet with 60%kcal fat irradiated）、0.5%纤维素钠安慰剂均由南京普克泰生物技术中心提供，清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号，由鬼针草、鬼箭羽、玄参等6味组成）由江苏省中医院制剂室供应。GAPDH、羊抗兔IgG-HRP（江苏凯基生物科技发展有限公司），Sirt1（武汉三鹰13161-1-AP），ECL检测试剂盒、全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒、Western blotting检测试剂盒、Braford蛋白含量检测试剂盒、预染蛋白分子量、丽春红染色液、苏木素-伊红染液试剂盒及FBS（江苏凯基生物科技发展有限公司），显色液、定影液（无锡市灵琦服务用品厂）。

1.3 分组与造模 18只4周龄雄性SHR大鼠自由摄食饮水，适应性喂养2周后（6周龄），随机分成3组，即正常饮食对照组、高脂饮食模型组、清肝滋肾中药组，每组大鼠均为6只。正常饮食对照组给予普通饲料喂养及等剂量的0.5%纤维素钠安慰剂，高脂饮食模型组予高脂饲料喂养及等剂量的0.5%纤维素钠安慰剂，清肝滋肾中药组给予高脂饲料及针箭颗粒［（22.5 g/（kg·d）］混悬液2 mL进行灌胃，共灌胃8周。

1.4 标本采集与检测 灌胃结束后，处死大鼠提取肝脏组织，冰水浴中冷0.9%氯化钠溶液冲洗，4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋备用。另取8 mm×8 mm肝脏组织置于10%中性甲醛溶液中固定，OCT包埋后，制成4~ 5 μm冷冻切片行油红 O染色。1）肝组织Sirt1及 Caspasel蛋白表达的检测。取冻存的肝组织，切成小块，加入FBS均液沉淀，吸取上清放入Buffer缓存液反复离心后提取胞浆蛋白和核蛋白，用Braford法进行蛋白定量，根据要求制胶，取适量待测样品蛋白加入染液中测定OD值，经SDS-PAGE电泳后，凝胶上铺上NC膜进行转模，再加入5%脱脂奶粉室温封闭1~2 h，用TBST洗膜10 min×3次，加入含一抗的平皿中，4℃摇床振荡孵育过夜，TBST洗10 min×3次。二抗室温摇床震荡1~2 h后，TBST洗膜10 min×3次，最后显影成像，使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析，GAPDH作内参照。2）苏木精-伊红（HE）染色制片检测肝脏的病理变化。取实验大鼠肝脏组织石蜡切片按常规方法进行脱蜡，水合，将切片用二甲苯浸泡5 min，更换二甲苯后再浸泡5 min；分别用无水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，PBS浸洗3 min×3次；根据苏木素-伊红染液试剂盒 （中国江苏凯基生物科技发展有限公司KGA224）操作步骤完成染色过程。3）油红O染色制片检测肝脏的病理变化。取新鲜肝脏组织制成冰冻切片，厚度4~5 μm；将标本置入60%异丙醇中浸10 min；入油红O染液中浸染，室温3~4 h；入60%异丙醇分化至背景无色；自来水冲洗1~3 min；苏木素复染；再予自来水冲洗1~3 min；甘油明胶封片。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（s）表示，两组间均数比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 清肝滋肾中药对高脂喂养SHR大鼠肝脏组织Sirt1和Caspase1蛋白表达的影响 见表1、图1。与正常饮食对照组相比，高脂饮食模型组肝脏组织Sirt1蛋白表达明显下降，Caspase1蛋白表达显著升高（P＜0.001）；与高脂饮食模型组比较，清肝滋肾中药组肝脏组织Sirt1蛋白表达上调，Caspase1蛋白表达降低（P＜0.05）。

表1 清肝滋肾中药对高脂喂养SHR大鼠肝脏组织Sirt1、Caspase1蛋白表达的影响（s）

表1 清肝滋肾中药对高脂喂养SHR大鼠肝脏组织Sirt1、Caspase1蛋白表达的影响（s）

与正常饮食对照组比较，*P＜0.001；与高脂饮食模型组比较，△P＜0.05。

组 别 n Sirt1/GAPDH Caspase1/GAPDH正常饮食对照组 6 0.617±0.021 0.070±0.010高脂饮食模型组 6 0.143±0.047*0.570±0.095*清肝滋肾中药组 6 0.303±0.081△0.173±0.086△

图1 各组大鼠肝脏组织Sirt1、Caspase1蛋白表达电泳条带

2.2 肝脏组织HE染色、油红O染色结果 见图2。HE染色光镜观察正常饮食对照组大鼠肝小叶结构清晰，细胞索整齐，核结构清晰，肝细胞无明显病理改变；高脂饮食模型组大鼠肝组织结构紊乱，部分肝细胞脂肪变性、沉积，呈大泡样改变；清肝滋肾中药组中亦可见脂肪浸润及脂肪空泡，但较高脂饮食模型组程度明显减轻。正常饮食对照组大鼠肝脏没有脂肪沉积，而高脂饮食模型组大鼠肝脏组织可见密集的脂滴，显示大量脂肪浸润，而清肝滋肾中药组脂滴密度和大小较高脂饮食模型组均有显著降低，表明清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）干预后可显著改善肝脏脂肪沉积。

图2 各组SHR大鼠肝脏组织学检测结果

3 讨 论

高血压是最常见的一种心脑血管疾病，以往多单纯将其归为血流动力学异常疾病范畴，随着对其病机认识的深入，明确其发生发展与肥胖、血脂异常、高血糖、胰岛素抵抗等代谢紊乱之间存在着密切的关系。众多研究也证实，在高血压患者人群中单纯高血压患者只占少数，绝大多数高血压均合并有不同形式的代谢紊乱［10］。因此，新的防治策略中，在强调降压达标的同时，更重视已明显发生或存在潜在发生风险的与高血压密切相关的各种代谢紊乱，从而最大程度地降低高血压患者的心脑血管风险。肝脏组织是调控机体糖脂代谢的重要组织器官，也是糖脂代谢紊乱的靶器官，研究表明，高脂饮食及肥胖可通过慢性炎症、氧化应激、脂质沉积等机制引起肝脏、肌肉等组织中出现脂肪的异位累积，导致机体糖脂等代谢紊乱［11-13］，沉默调节蛋白1（Sirt1）属于一类具有多种生理功能的蛋白去乙酰化酶，在哺乳动物的肝脏、脂肪组织、肌肉等多种器官、组织中广泛表达，其与SIR2的同源性最高，也是近年来Sirtuins家族成员中得到最深入研究的一项，在人体内，Sirt1通过调控多种控制代谢和胰岛素信号通路的转录因子，来参与体内众多生理功能的调节，在糖脂代谢、炎症反应、胰岛素分泌等过程中发挥着重要的调节作用［14-16］。即机体可通过升高或降低Sirt1表达水平，来发挥其调节相关的转录因子的活性，从而起到影响物质代谢平衡的作用。清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）是导师蒋卫民教授基于对高血压相关代谢紊乱的中医基本病因病机的探索，对既往已被基础及临床研究证实可以明确改善高血压相关代谢障碍的针箭颗粒组方的进一步优化，并通过本研究进一步探讨其改善高血压代谢紊乱的机制。本实验通过分析高脂饮食SHR大鼠和正常饮食SHR大鼠及清肝滋肾中药干预后的大鼠肝脏组织Sirt1蛋白的表达水平变化，发现与正常饮食对照组比，高脂饮食模型组Sirt1蛋白表达显著下调，其裂解酶Caspase1蛋白表达升高（P＜0.001），与高脂饮食模型组相比，清肝滋肾中药干预后肝脏组织Sirt1蛋白表达水平明显上调，Caspase1蛋白表达也出现显著降低（P＜0.05），提示清肝滋肾中药（针箭颗粒Ⅱ号）可能通过抑制Caspase1活性，上调Sirt1蛋白表达，而发挥其改善高血压相关代谢紊乱的作用，但其作用的确切机制还待今后的研究中设计Sirt1基因敲除相关动物模型的实验来证实。

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Effect of Qinggan Zishen Chinese Medicine on Sirt1 Protein Expression in Liver Tissue of Spontaneously Hypertensive Rats Fed with High Fat Diet

ZHAN Meijin，ZHANG Xiaoxiao，YIN Xiaowei，et al.Nanjing U-niversity of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210000，China.

Objective：To investigate the effect of Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）on the expression of Sirt1 protein in liver tissue and fatty infiltration in hepatocytes of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet.Methods：Eighteen male SHR aged 4 weeks were randomly divided into the normal diet group（normal diet+placebo），the high-fat diet model group（high fat diet+placebo）and the Qinggan Zishen herbs group（high fat diet+Zhenjian granuleⅡ）.After 8 weeks of intervention，the liver tissues of rats were taken，and the expression of Sirt1 and Caspase1 protein was detected by Western blotting method，and the fatty infiltration of hepatocytes was observed by HE staining and oil red O staining respectively.Results：Compared with the normal diet group，the expression of Sirt1 protein in the high-fat diet model group was lower，and the expression level of Caspase1 was significantly higher（P＜0.001）.Compared with the high-fat diet model group，the Qinggan Zishen herbs group increased the expression level of Sirt1 protein，the expression level of Caspase1 was decreased obviously（P＜0.05）.HE staining and oil red O staining showed that the liver tissue structure disorder and large amount of fat infiltration were caused by high fat diet，and the density and size of lipid droplet in the Qinggan Zishen herbs group were significantly lower than those of the high-fat diet model group.Conclusion：Qinggan Zishen traditional Chinese medicine（Zhenjian granuleⅡ）can significantly raise the expression of Sirt1 protein in liver tissue of spontaneously hypertensive rats（SHR）fed with high fat diet，and markedly reduce the fatty infiltration of liver in SHR rats，and thus playing an important role in improving hypertension-related metabolic disorders.

Essential hypertension；High fat；Qinggan Zishen herbs；Sirt1

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0381-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.002

2016-12-10）

国家自然科学基金资助课题（81373605）；江苏省中医药局资助课题（LZ13030）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

△通信作者（电子邮箱：jwm0410@163.com）