miRNA21抑制物对食管癌细胞凋亡的影响

郑鹏超,李磊

(荆门市第二人民医院心胸外科，湖北 荆门 448000)

miRNA21抑制物对食管癌细胞凋亡的影响

郑鹏超,李磊

(荆门市第二人民医院心胸外科，湖北 荆门 448000)

目的：利用miRNA21抑制物抑制食管癌细胞系ECA-109中miRNA21的表达，观察对ECA-109细胞凋亡的影响，为探讨miRNA21抑制物在食管癌治疗中的应用提供理论参考。方法：以正常培养的ECA-109细胞为空白对照组，转染miRNA21抑制物阴性对照物作为阴性对照组，转染miRNA21抑制物作为实验组，通过MTT法、流式细胞术、实时荧光定量PCR研究miRNA21抑制物对ECA-109细胞增殖、凋亡及凋亡相关基因表达的影响。结果：与空白对照组和阴性对照组相比，转染miRNA21抑制物能够显著性地抑制ECA-109细胞的增殖 (P<0.05)，并且明显提高ECA-109细胞的凋亡率(P<0.05)，促进细胞凋亡。同时，转染miRNA21抑制剂的实验组ECA-109细胞中促凋亡基因caspase3、p53、在mRNA水平的表达均显著升高 (P<0.05)，而抗凋亡基因Bcl-2的表达则被显著抑制 (P<0.05)。结论：miRNA21抑制剂能够抑制食管癌细胞ECA-109的增殖，增强促凋亡相关基因的表达，促进癌细胞的凋亡；miRNA21具有明显的原癌基因样功能，可作为食管癌细胞治疗的靶标。

食管癌；miRNA21；miRNA21抑制物；细胞凋亡

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类保守的非编码RNA，其长度约为20～24个核苷酸，能够与mRNA特异性性结合，介导靶基因mRNA的降解，从而参与基因的表达调控[1-2]。目前，miRNA21是唯一被报道在多种实体肿瘤(如肺癌、乳腺癌、食管癌)中都呈现过表达的miRNA，能够参与肿瘤的生长、侵袭、转移等，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[3-5]。因此，探索miRNA21抑制物在癌细胞凋亡中的作用，能够为临床癌症治疗提供重要的理论参考。本文以反义寡核苷酸作为miRNA21抑制物，转染食管癌细胞系ECA-109，初步探讨miRNA21抑制物对食管癌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

食管癌细胞系ECA-109 (中国科学院上海细胞库)；miRNA21抑制物和miRNA21抑制物阴性对照物 (上海艾博思生物公司)；DharmaFECT转染试剂 (美国Thermo)；RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、台盼蓝、噻唑蓝 (MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)、青霉素、链霉素 (上海索莱宝生物公司)；TRIzol、cDNA快速逆转录试剂盒、Ultra SYBR mixture试剂盒 (北京天跟生物公司)；imark全自动酶标仪、IQ5实时荧光定量PCR仪、S3全自动化流式细胞仪 (美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 食管癌上皮细胞ECA-109为贴壁生长细胞，采用单层贴壁式培养。基础培养液为RPMI1640，加入10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素，置于37 ℃培养箱 (5% CO2)恒温培养。转染前48 h，将细胞转移至不含抗生素的RPMI1640培养基中，用六孔细胞培养板培养至细胞汇合度达80%左右。用不含血清的RPMI1640培养基将miRNA21抑制物及其阴性对照物稀释至200 ng/mL，将二者分别与RPMI1640培养基稀释后的DharmaFECT转染试剂 (1∶100稀释) 等体积混合，室温静置5～10 min。将含miRNA21抑制物的混合液1 mL加入1个细胞培养孔，作为实验组 (miRNA21 inhibitor)；将含miRNA21抑制物阴性对照物的混合液1 mL加入1个细胞培养孔，作为阴性对照组 (miRNA21 inhibitor NC)；将1 mL不含抗生素的RPMI1640培养基加入一个培养孔，作为空白对照组 (Blank)。

1.2.2 MTT法检测细胞增值 将处于对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化成单细胞悬液，取少量用台盼蓝染色法计数。将细胞密度稀释至1×104个/mL，并转移至新的培养基中培养；24 h后，按照上述方法进行细胞转染实验。每组于转染后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h分别取出一板用于MTT法检测细胞增长，每个时间点每组设定3个平行孔。MTT法具体实验方法是：每孔加入25 μL MTT溶液(5 μg/μL)，置于37 ℃温箱中孵育4～5 h，小心吸去上清液；每孔加入200 μL DMSO，轻摇至结晶沉淀物溶解；用imark全自动酶标仪测定490 nm波长的吸光度值A；以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线；细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将处于对数生长期的细胞按照上述方法调整细胞浓度至5×105个/mL，采用无血清培养进行细胞同步化处理；随后，按上述方法进行细胞转染实验；72 h后，将细胞消化成单细胞悬液，用PBS缓冲液洗涤2～3次，将细胞密度稀释至1×106个/mL；置于4 ℃，用70%乙醇固定12 h以上；用5 mg/L溴乙锭染色20 min；用500目尼龙网过滤细胞悬液，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 实时荧光定量PCR实验 将进行细胞转染实验48 h的各组细胞收集 (每组收集3个培养孔)，用PBS洗涤2～3次，加入1 mL TRIzol试剂裂解细胞，并按照酚-氯仿抽提法提取细胞总RNA。参照天根生物科技公司的cDNA快速逆转录试剂盒提供的使用说明进行cDNA的逆转录合成。用实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因Caspase3、p53、Bcl2基因的表达变化。所用引物序列如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR实验所用引物序列

1.3 统计学分析

利用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计分析；利用GrahPad Prism5.0绘制折线图及柱形图。

2 结果

2.1 miRNA21抑制物对ECA-109细胞增殖的影响

利用MTT比色法绘制细胞增殖曲线，由图1所示：在各测定时间点，空白对照组与阴性对照组的细胞增值曲线相互重合，未产生明显差异；而转染miRNA21抑制物则能够显著抑制ECA-109细胞的增殖 (P<0.05)，且随着时间延长抑制效果增强；与阴性对照组相比，转染48 h时细胞增殖抑制率为31%，72 h抑制率为53.7%，96 h抑制率为58.8%，120 h抑制率为59.2%。

2.2 miRNA21抑制物对ECA-109细胞凋亡的影响

表2所示为细胞凋亡率的变化。空白对照组和阴性对照组中细胞的凋亡率分别为 (12.23±1.12)%、(13.18±0.98)%，二者无显著性差异 (P>0.05)；转染miRNA21抑制物的实验组细胞凋亡率为 (35.27±1.34)%，显著高于空白对照组和阴性对照组 (P<0.05)。

组别细胞凋亡空白对照组12．23±1．12阴性对照组13．18±0．98抑制物35．27±1．34

注：凋亡率代表3次独立平行实验。

2.3 miRNA21抑制物对ECA-109细胞中凋亡相关基因表达的影响

在细胞凋亡中，caspase-3是细胞凋亡过程中最重要的终末剪切酶，是细胞凋亡的执行者；p53作为一种抗癌基因产物，能够诱导细胞凋亡；Bcl-2作为一种原癌基因产物，能够参与调控线粒体功能，阻断p53诱导的细胞凋亡[6-8]。因此，我们通过检测miRNA21抑制物对caspase-3、p53、Bcl-2基因的表达，探讨miRNA21抑制物影响细胞凋亡的可能机制。如图2所示，与空白对照组相比，转染miRNA21阴性对照物的阴性对照组细胞中caspase-3、p53、Bcl-2基因的表达均未出现显著性变化 (P>0.05)；而转染miRNA21抑制物的实验组细胞中，促凋亡基因caspase-3、p53基因的表达明显高于空白对照组和阴性对照组 (P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2基因的表达则明显降低 (P<0.05)。

3 讨论

食管癌是最常见的消化道肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。我国是世界上食管癌高发区之一，每年有超过15万人死于食管癌。目前，食管癌的治疗以手术治疗为首要疗法，但仍需配合化学治疗、放射治疗方能稳定疗效。然而，放射治疗和化学治疗所带来的不良反应严重影响患者生活质量。因此，亟需开发新的食管癌质量手段，以避免不良反应、稳定疗效、提高治愈率。

miRNA作为重要的基因转录后表达调控因子，已被证明在多种癌细胞增殖、迁移和凋亡中都发挥着至关重要的调节功能[9]。目前，已有大量的研究证实miRNA-21在心血管系统、呼吸系统、消化系统等多种疾病中都具有重要的调节功能，参与多种肿瘤细胞的增殖、迁移、肿瘤血管生成和抗药性形成等。在非小细胞肺癌、肝癌等癌组织中，miRNA21都有异常性的升高表达，循环中的miRNA21已被选择多种癌症早期检测的标志物[10-11]。在恶性胶质细胞瘤、舌鳞状细胞癌中，miRNA21被证实能够作为凋亡抑制因子，保护癌细胞免受化疗诱导的细胞凋亡[12-13]。这些研究成果充分证实miRNA21在肿瘤细胞凋亡中发挥着至关重要的功能，拮抗miRNA21抗细胞凋亡作用有可能成为癌症治疗的新靶点。

本研究利用miRNA21抑制物拮抗miRNA21的功能，对miRNA21抑制物在人食管癌细胞凋亡中的功能进行了初步探讨。研究发现，转染miRNA21抑制物48 h后，人食管癌细胞系ECA-109细胞增殖受到显著性地抑制，并且随着转染时间的延长，细胞增殖抑制率明显升高，最高可达59.2% (转染后120 h)；而转染miRNA21抑制物的阴性对照物则不对ECA-109细胞的增殖产生显著影响。更重要的是，转染miRNA21抑制物能够显著提高ECA-109细胞的凋亡率。转染72 h后，miRNA21抑制物转染组的细胞凋亡率可达 (35.27±1.34)%，显著高于阴性对照组的 (13.18±0.98)%。这些结果表明：转染miRNA21抑制物能够有效地拮抗miRNA21抗细胞凋亡的作用，抑制食管癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。

为进一步证实上述结论，实验检测了miRNA21抑制物对几种凋亡相关基因表达的影响。有文献研究证实miRNA21能够通过影响Bcl-2的表达、调节caspase-3和p53活性等方式参与细胞凋亡的调控[14-16]。本研究选择caspase-3、p53和Bcl-2作为代表，检测miRNA21抑制物对凋亡相关基因表达的影响。结果表明，转染miRNA21抑制物能够明显地提高促凋亡基因caspase-3、p53基因在mRNA水平的表达，而抗凋亡基因Bcl-2在mRNA水平的表达则被显著抑制。这些结果进一步证实miRNA21抑制物能够拮抗miRNA21的功能，促进食管癌细胞的凋亡。

本研究研究了miRNA21抑制物对食管癌细胞凋亡的影响，证实miRNA21抑制物能够拮抗miRNA21的功能，调控凋亡相关基因的表达，抑制食管癌细胞的增值，促进癌细胞凋亡。这些研究成果证实应用miRNA21抑制物能够作为临床应对食管癌的新疗法，相应的研究成果为miRNA21抑制物的临床应用提供了重要的理论参考。

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(学术编辑：李祖茂)

The influence of miRNA21 inhibitor on esophageal carcinoma cell apoptosis

ZHENG Peng-chao，LI Lei

(DepartmentofCardio-ThoracicSurgery,TheSecondPeople’sHospitalofJingmen,Jingmen448000,Hubei,China)

Objective：The purpose of this study was to provide theoretical reference for the application of miRNA21 inhibitor in the treatment of esophageal carcinoma,by using miRNA21 inhibitor miRNA21 expression in ECA-109 esophageal cancer cell lines,to observe the influence of the ECA-109 cell apoptosis.Methods：The cultured ECA-109 cells were divided into blank control group (normally cultured),negative control group transfected with negative miRNA21 inhibitor,and the experimental group transfected with miRNA21 inhibitor.The influence of miRNA21 inhibitor on cell proliferation,apoptosis and apoptosis-related gene expression of ECA-109 cells was repectively investigated by MTT method,flow cytometry and real-time fluorescence quantitative PCR.Results：Compared with blank and negative control groups,the transfection of miRNA21 inhibitor significantly inhibited the proliferation of ECA-109 cells (P<0.05),significantly elevated the percent of apoptotic cells (P<0.05) and promoted its apoptosis.While,the expression of pro-apoptotic genes as caspase3 and p53 was significantly elevated in ECA-109 cells of experimental group (P<0.05).However,anti-apoptotic gene Bcl-2 was significantly inhibited (P<0.05).Conclusion：miRNA21 inhibitors can inhibit the proliferation of esophageal cancer cell ECA-109,enhance the expression of pro-apoptotic genes and promote the apoptosis of esophageal carcinoma cells.Therefore,miRNA21 has the similar function of oncogene,which can be used as a target for the treatment of esophageal carcinoma cells.

Esophageal cancer;miRNA21;miRNA21 inhibitor;Apoptosis

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.022

2016-08-20

郑鹏超(1978-)，男，硕士，副主任医师。E-mail：1085209450@qq.com

时间：2017-3-6 21∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2108.044.html

1005-3697(2017)01-0078-04

R735.1

A