子宫腺肌病神经生长因子蛋白表达水平与盆腔疼痛的发生机制研究

邓丽，刘其友

(1.中国石油大学华东医院；2.中国石油大学华东生物工程与技术中心，山东 青岛 266580)

子宫腺肌病神经生长因子蛋白表达水平与盆腔疼痛的发生机制研究

邓丽1，刘其友2

(1.中国石油大学华东医院；2.中国石油大学华东生物工程与技术中心，山东 青岛 266580)

目的：探讨子宫腺肌病神经生长因子(nerve growth factor，NGF)蛋白表达水平与盆腔疼痛的关系。方法：选取因子宫腺肌病行子宫全切除的患者51例，根据疼痛情况分为无痛组(无盆腔疼痛)15例，疼痛组36例；选取同期子宫肌瘤及行子宫切除的宫颈上皮内瘤变患者32例为对照组。无痛组和疼痛组术中取子宫腺肌病病灶，对照组取子宫内膜；免疫组化检测NGF蛋白表达水平，免疫荧光法检测蛋白基因产物(protein gene product,PGP)9.5阳性神经纤维数。结果：疼痛组NGF蛋白表达明显强于无痛组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；无痛组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。疼痛组PGP 9.5阳性神经纤维密度明显高于无痛组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；无痛组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。子宫腺肌病盆腔重度疼痛者NGF蛋白表达强于轻中度痛和无痛者，PGP 9.5阳性神经密度明显高于轻中度痛和无痛者，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：子宫腺肌病NGF蛋白表达水平提升参与盆腔疼痛的发生机制，促进病灶内膜神经纤维植入为其机制之一。

子宫腺肌病；盆腔痛；神经生长因子

盆腔疼痛为子宫腺肌病的主要临床症状之一，其疼痛机制目前仍未明确，与病灶内膜神经纤维植入异常，病灶范围、深度、炎症状态等因素有关[1]。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)属神经营养家族，具体增加神经敏感性、伤害感受器数量、炎症反应等作用。相关研究显示：NGF可能参与子宫内膜异位症疼痛发生机制[2]；动物实验发现子宫腺肌病小鼠病灶NGF蛋白表达水平和病情进展呈明显正相关[3]。蛋白基因产物(protein gene product, PGP)9.5为高特异性的神经标志物，可有效反映出有髓神经纤维状态，该类神经纤维密度增加可能提升痛觉敏感性度[4]。本次研究通过检测子宫腺肌病患者病灶NGF蛋白表达情况和PGP 9.5阳性神经纤维密度，分析NGF蛋白表达对局部神经植入及盆腔疼痛的影响，探讨NGF在子宫腺肌病盆腔疼痛的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2015年6月间在本院因子宫腺肌病行子宫全切除的患者51例，根据疼痛情况分为无痛组15例，疼痛组36例，术后均经病理确诊。其中无痛组患者平均年龄(44.5±3.8)岁，平均月经周期(28.1±2.4)d，术前末次月经至手术当日(20.0±4.0)d；疼痛组患者平均年龄(45.2±3.5)岁，平均月经周期(28.9±3.1)d，术前末次月经至手术当日(20.0±5.0)d。选取同期子宫肌瘤及行子宫切除的宫颈上皮内瘤变患者32例为对照组，平均年龄(44.1±4.6)岁，平均月经周期(29.1±3.0)d，术前末次月经至手术当日(19.0±7.0)d。3组患者术前2个月内均无性激素类药物服用史，未放置宫内节育器，均自愿参与本次研究并签署之情同意书。3组患者年龄、月经周期、末次月经至手术当日间隔天数之间差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集与处理 无痛组和疼痛组患者行子宫全切术后，快速剖开切下的子宫，在子宫肌层寻找并切取子宫腺肌病病灶结节；对照组切取患者子宫内膜。获得的标本均置于含4 %甲醇的中性缓冲液中固定，4 ℃冷藏保存。

1.2.2 NGF蛋白表达检测 采用免疫组化SP法检测标本中NGF蛋白表达水平，具体为：常规石蜡包埋固定后的标本，5 μm连续切片，二甲苯、酒精常规梯度脱蜡，0.01 mol/L枸橼酸缓冲液修复抗原。加兔抗人多克隆NGF抗体(1:500)，4 ℃孵育过夜，加生物素标记二抗，37 ℃孵育10 min，加HRP标记的链霉素亲和素工作液，37 ℃孵育10 min，DAB染色，苏木素复染。常规脱水、透明、干燥、封片，观察并采集图像，PD Quest 8.0.1软件分析NGF蛋白表达水平。

1.2.3 PGP 9.5阳性神经纤维检测 采用亲和素-异硫氰酸荧光素免疫荧光染色法进行检测，具体为：标本固定至抗原修复同上。加兔抗人多克隆抗体PGP 9.5(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，加生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min，加FITC标记的链霉素亲和素工作液，37 ℃孵育30 min，抗荧光淬灭封片剂，观察并采集图像，荧光纤维镜下计数5个高倍镜(×400)视野下PGP 9.5阳性神经纤维数，计算神经纤维密度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3组NGF蛋白表达水平比较

NGF蛋白在子宫腺肌症患者的异位、在位内膜以及对照组在位内膜的腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，在子宫肌细胞中均无表达，见图1。NGF蛋白在3组中的表达水平分别为：无痛组0.20±0.04、疼痛组0.26±0.07、对照组0.19±0.04，疼痛组NGF蛋白表达明显强于无痛组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；无痛组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 3组PGP 9.5阳性神经纤维密度比较

子宫腺肌症患者病灶以及对照组子宫内膜基底层均可见PGP 9.5阳性神经纤维，见图2。PGP 9.5阳性神经纤维3组中的密度分别为：无痛组(12±6)条/mm2、疼痛组(17±9)条/mm2、对照组(10±5)条/mm2，疼痛组PGP 9.5阳性神经纤维密度明显高于无痛组、对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；无痛组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 子宫腺肌病患者盆腔疼痛与NGF蛋白表达、PGP 9.5阳性神经纤维密度的关系

根据VAS评分将子宫腺肌病盆腔疼痛分为无痛、轻中度痛、重度痛。其中重度疼痛者NGF蛋白表达强于轻中度痛和无痛者，PGP 9.5阳性神经密度明显高于轻中度痛和无痛者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

程度nNGF蛋白表达水平PGP9．5阳性神经密度(条/mm2)无痛150．19±0．06∗12±6∗轻中度痛160．23±0．08∗14±5∗重度痛200．30±0．0820±11

*P<0.05，与重度疼者相比。

3 讨论

3.1 子宫腺肌病NGF蛋白表达水平升高的意义

NGF主要由神经支配的靶器官分泌并被神经末梢摄取和转运，在机体多个组织器官中均有表达[5]。NGF为一种具有神经营养活性的多功能因子，能够促进感觉和交感神经纤维修复和增殖；可调节机体免疫系统，促进炎性细胞聚集、肥大细胞脱颗粒，增强炎症反应[6]；还可通过提升机体伤害感受器数目及敏感性，诱导致痛物质释放等多种途径加重疼痛、过敏程度[7]。相关研究显示，子宫腺肌症小鼠的子宫NGF蛋白表达提升的同时出现局部神经、组织炎症，且表达强度与腺肌病的病程进展存在相关性[8]。本次研究中患者病灶腺上皮细胞和间质细胞中均存在NGF表达，且盆腔痛患者中病灶NGF表达水平明显高于无盆腔痛患者，提示NGF可能参与子宫腺肌病疼痛发生，其主要通过局部作用参与子宫腺肌病的疼痛机制而非全身作用。

3.2 子宫腺肌病NGF蛋白表达水平与盆腔疼痛关系

盆腔痛为子宫腺肌病患者疼痛的主要表现形式。本次研究中子宫腺肌病重度疼痛者子宫腺疾病病灶NGF蛋白表达水平明显高于轻中疼痛和无痛者，而患者是否存在盆腔痛、性交痛与NGF蛋白表达水平之间无明显差异[9]。子宫腺肌病、子宫内膜异位症的机制较为复杂，目前尚未明确，关于较为普遍的观点为多因素诱导伤害感受器数量提升、痛觉过敏降低了痛域，患者经期受到前列腺素、子宫收缩等多因素刺激出现疼痛[10-11]。当患者病灶NGF分泌异常升高，NGF可介导神经和组织炎症，对神经系统和免疫系统双调节，产生痛觉过敏。此外，NGF能够直接提升伤害感受器数量，参与疼痛机制[12]。本次研究中子宫腺肌病盆腔疼痛患者病灶NGF表达水平明显高于对照组，和相关研究结果基本一致。

3.3 子宫腺肌病PGP 9.5阳性神经植入密度与NGF蛋白表达水平的关系

本次研究中子宫腺肌病疼痛患者病灶处PGP 9.5阳性神经植入密度明显高于无痛患者和对照组，且与严重程度相关。提示子宫腺肌病病灶中的神经植入高密度状态可能与患者盆腔疼痛相关。目前，引发子宫内膜异位症、子宫腺肌病病灶、在位内膜神经纤维植入异常的相关机制仍未明确，认可度较高的最直接因素为：部分诱导神经生长的营养因子分泌量增加，营养局部组织神经[13-14]。NGF为最早发现的神经营养因子，起到维持感觉神经及交感神经活性，促进周围神经再生等作用[15]。本次研究中子宫腺肌病盆腔疼痛患者病灶NGF蛋白表达水平高于无痛组，其中重度疼痛患者NGF蛋白表达水平明显高于无痛组，且与PGP 9.5阳性神经纤维植入密度呈正相关，进一步证实了宫腺肌病病灶处神经纤维密度增加可能与NGF分泌量提升有关。

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(学术编辑：买文丽)

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Study on the relationship between the expression level of NGF protein and the mechanism of pelvic pain in patients with uterine gland

DENG Li1,LIU Qi-you2

(1.EastHospitalofChinaUniversityofPetroleum；2.CenterforBioengineering&BiotechnologyinEastChina,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,Shandong,China)

Objective：To investigate the relationship between the expression level of nerve growth factor (NGF) protein and the mechanism of pelvic pain in patients with uterine gland disease.Methods：51 patients with total resection of uterine adenomyosis,51 cases, according to the pain points for painless group 15 cases,pain group 36 cases.Selected the same period uterine myoma and uterine resection of cervical intraepithelial neoplasia in patients with 32 cases as the control group.Painless group and pain group take the uterine adenomyosis lesions in surgery,the control group take the endometrium.The expression level of protein was detected by immunohistochemistry,and the number of nerve fibers in the white gene positive product (PGP) was detected by immunofluorescence assay.Results：The expression of NGF protein in pain group was significantly stronger than that in painless group and control group,the difference was statistically significant (P<0.05),there was no significant difference between the painless group and the control group (P>0.05).Pain group PGP 9.5 positive nerve fiber density was significantly higher than the painless group and the control group,the difference was statistically significant (P<0.05),there was no significant difference between the painless group and the control group (P>0.05).The expression of NGF protein was stronger than that of mild to moderate pain and pain in patients with severe dysmenorrhea,PGP 9.5 positive nerve density was significantly higher than that of mild and moderate pain and painless,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusions：The level of NGF protein expression in the uterine gland is promoted to participate in the pathogenesis of dysmenorrhea,and promote the mechanism of the insertion of the nerve fiber.

Uterine gland disease;Pelvic pain;Nerve growth fact

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.01.026

2016-04-18

邓丽(1977-)，女，主治医师。E-mail:wangcw@upc.edu.cn.

时间：2017-3-6 21∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170306.2108.052.html

1005-3697(2017)01-0093-03

R711.71

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