超声微泡在乳腺癌靶向治疗中的作用机制研究进展

姜矜君，赵云

(三峡大学医学院，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北宜昌443002)

超声微泡在乳腺癌靶向治疗中的作用机制研究进展

姜矜君，赵云

(三峡大学医学院，肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北宜昌443002)

超声微泡携带药物或基因靶向治疗肿瘤是目前的研究热点。超声微泡可通过提高肿瘤细胞膜的通透性、对血管内皮和邻近组织的机械损伤作用，对肿瘤细胞产生杀伤作用。超声微泡可靶向递送紫杉醇等化疗药物，降低药物毒副作用，提高肿瘤局部的药物浓度，增强化疗药对肿瘤细胞的杀伤力。超声微泡可将外源基因导入乳腺癌细胞，以纠正靶细胞的功能缺陷，促进细胞凋亡。超声微泡可通过靶向递送单克隆载体进行免疫治疗，活化免疫系统，增强机体免疫能力，抑制肿瘤的发生发展。

微泡；超声微泡；乳腺肿瘤；乳腺癌

化疗是乳腺癌的常用治疗方法，但普通抗肿瘤药物无法实现在肿瘤部位的靶向聚集并渗透到肿瘤内部，治疗乳腺癌效果不佳。超声微泡携带药物或基因靶向治疗肿瘤是近年来超声分子影像学的研究领域的热点，在肿瘤早期的检测和疗效评价方面具有可观的应用前景。超声微泡靶向治疗是将超声微泡作为药物或基因载体，在靶组织区域给予一定强度的超声辐照导致微泡破裂，产生“击破效应”，使其携带的药物或基因定向释放到肿瘤组织，提高肿瘤组织的药物浓度，达到靶向治疗肿瘤的目的。现将相关研究进展综述如下。

1 超声微泡在乳腺癌治疗中的作用机制

理想的超声微泡应具备安全无毒、粒径小而均匀、载药量高，包封率高、靶向性好、体内稳定性好且易被超声击破。目前所采用的超声微泡均由外膜和包裹的惰性气体组成，直径均小于8 μm，可以通过肺毛细血管，在超声的作用下被激发，产生较强的回波性能，增强肿瘤组织的回声，提高肿瘤组织显影度。超声刺激下的微泡可产生微射流、冲击波、流体喷射波，崩裂时可产生高温、高压，超声刺激微泡产生振荡、膨胀、坍塌的各种机械力使血管破裂来增加大分子，基因和细胞的穿透力[1，2]。

1.1 提高肿瘤细胞膜的通透性 超声微泡可提高肿瘤细胞膜的通透性，促进微泡内容物吸收。Jenne等[3]报道，超声微泡可增加细胞膜通透性，且不损伤中性粒细胞的活性。Taniyama等[4]研究也发现，微泡破裂可明显提高肿瘤细胞膜的通透性，甚至使细胞产生暂时、可逆性小孔。

多数肿瘤中，与临床诊断相关的特征性分子标记物都位于肿瘤实质细胞上或者血管外基质内。微泡对肿瘤的靶向显影大多集中在血管内皮上血管内皮生长因子受体(VEGFR2)、整合素αvβ3、血管细胞黏附分子(VCAM-1)、P选择素等靶点[5]。传统的微米级微泡造影剂相对粒径较大(2～10 mm)，难以穿过肿瘤新生血管(380～780 nm)，不能渗透到血管外组织，使其对肿瘤实质和血管外基质分子的血管靶向分子显影受到限制。Anderson等[6]将能与αvβ3特异性结合的物质连接到微泡上，对Met-1原位乳腺癌移植瘤进行超声显像，发现靶向微泡组的对比信号较非靶向组提高了33倍。Willmann等[7]利用生物素-链亲和素相互作用制成携VEGFR2的单克隆抗体靶向微泡造影剂，体外实验显示其与VEGFR2阳性细胞的结合率显著高于非靶向微泡造影剂,且显著高于VEGFR2阴性细胞的结合率。

随着相变型氟碳纳米粒子、纳米级脂质微泡等纳米级微泡的成功研制，超声微泡在分子显像、药物传送、基因转染及多学科交叉等领域得到快速发展，成为给肿瘤血管外显影的一项新方法，。肿瘤新生血管内皮细胞连接不健全，血管内皮间隙扩大到380～780 nm，血管通透性增加，淋巴回流受阻，从而导致肿瘤细胞的高通透性和滞留效应。ER[8，9]、PR、HER2[10]是乳腺癌组织中特异性分子标志物。有学者[11]用聚焦超声(FUS)联合微泡空化血脑屏障后，将HER2 阳性的脑转移人乳腺癌细胞(MDA-MB-361)接种到裸鼠上，结果显示治疗期间，超声联合抗体组处理后的肿瘤平均体积显著小于单独使用超声治疗组和单独使用抗体治疗组。目前针对肿瘤实质及血管外基质的特征性标志物方面的研究很多[12，13]，但是超声微泡针对肿瘤实质及血管外基质的特征性标志物的药物治疗方面的研究尚少，因此制备出携带有肿瘤实质特征性标志物的超声微泡具有可观临床应用前景。

1.2 对血管内皮和邻近肿瘤组织的机械损伤 超声微泡在血管壁内流动时，由于超声的空化效应，可导致血管壁和邻近肿瘤组织发生机械损伤，甚至使微血管破裂出血，血管通透性增加，增加内皮间隙。促进周围细胞氧化应激，启动局部炎症反应，同时促进巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞浸润。超声微泡可使肿瘤组织微小血管破裂，阻断肿瘤组织血管新生；促进基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)、血管细胞黏附附分子(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达,有助于内皮细胞和损伤组织修复。Wood等[14]用静脉注射微泡联合低频率超声作用于小鼠移植性黑色素瘤，发现超声辐照后肿瘤血流灌注下降，无灌注区域面积较治疗前增大82%。

2 超声微泡靶向递送的物质在乳腺癌治疗中的作用机制

2.1 超声微泡靶向递送化疗药物 肿瘤的化疗效果取决于化疗药物在肿瘤局部的有效浓度及持续时间。采用化疗药物可延长乳腺癌患者的生存期，但不良反应一直是限制其临床应用的主要问题。紫杉醇是一种脂溶性药物，是常用的临床乳腺癌化疗药物，但其导致的化疗不良反应较多。将紫杉醇包载于微泡中既降低了药物毒副作用，同时提高肿瘤局部的药物浓度。目前超声微泡载紫杉醇、阿霉素用于治疗乳腺癌的研究已经非常广泛，制备技术已经十分成熟，但都处于动物和细胞实验阶段，尚有待于进一步临床研究进一步应进行应用于临床研究是亟待解决的问题。Yan等[15]制备出载紫杉醇脂质体微泡复合物，在体内外实验证实该复合物较紫杉醇能更有效的抑制肿瘤生长。有学者[16]制备共载阿霉素(DOX)和维拉帕米(VER)双修饰脂质CL-R8-LP(DOX+VER)，考察其对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用，结果发现将DOX和VER共同包载于共修饰脂质体中可显著提高对MCF-7细胞的杀伤力。P-糖蛋白(P-gp)在肿瘤细胞膜上过度表达是其耐药性的主要机制之一[17]，最常用的解决方法是将P-gp抑制剂和化疗药物联用，VER作为P-gp抑制剂，双修饰脂质体(CL-R8-LP)有良好的肿瘤靶向传递能力，将CL-R8-LP作为化疗药物和P-gp抑制剂的载体，化疗药物在P-gp抑制剂的协同作用下，可有效地蓄积于胞内进而抑制并杀死肿瘤细胞。超声微泡携带药物不仅降低了药物的毒副作用，且提高药物在肿瘤局部的浓度，增强了对肿瘤组织的杀伤作用。

2.2 超声微泡靶向递送基因 超声微泡作为载体不但可以在体循环中减少药物的副作用提高病变区域的药物浓度，还可以保护药物和基因片段不被核酸酶降解和内皮网状系统清除。基因治疗作用即用基因工程技术，将外源基因导入靶细胞，以纠正靶细胞功能缺陷或者为其提供一个新功能。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术是一种靶向、高效的基因输送方法，能有效促进基因的转染和表达，是一种安全有效的基因传输方式。基因载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体虽然转染效率高，但存在免疫原性，潜在的致肿瘤性和低携带能力；而非病毒载体转染效率低。如何制备转染效率高的非病毒载体成为基因治疗的新方向。超声微泡属于一种非病毒载体，具有制备简单、转染效率高、无免疫原性等优势[18]。目前超声微泡作为基因的载体已经广泛应用到肿瘤、干细胞移植、心血管疾病等的基础研究中，具有广阔的应用前景。

基因转染成功的关键是如何将外源基因成功的、高效的转入靶组织，并调控基因的表达。基因转染的理想条件是提高细胞膜的通透性而对周围组织的伤害减少到最低，微泡的空化效应很好的体现了这一优点。有学者[19]将靶向超声微泡与CD/TK双自杀基因质粒联合前药转染到具有KDR启动子乳腺癌MCF-7细胞中，给予超声辐照，结果显示KDR启动子可以驱使CD/TK双自杀基因在MCF-7细胞中靶向表达，KDRP-CD/TK基因在体外对MCF-7细胞具有靶向杀伤作用。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，可促进肿瘤分裂增殖，通过抑制survivin基因表达，干扰survivin的Thr34磷酸化可使处于有丝分裂中的癌细胞发生凋亡并增加化疗药物诱导癌细胞凋亡的作用。有学者[20]构建沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体，采用反相蒸发-机械振荡法制备出siRNA真核表达载体的脂质微泡，体外实验显示，载基因靶向微泡可特异性结合到高表达HER-2的乳腺癌细胞上并诱导癌细胞凋亡。微泡作为基因的载体的安全性、有效性及稳定性已在国内外许多学者的实验中得到证实，但是其应用于临床仍有诸多挑战。

2.3 超声微泡靶向递送单克隆载体 免疫治疗即调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤能力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞。将单克隆抗体通过化学连接法与微泡连接，制备出靶向超声微泡，并对微泡表面进行修饰，实现微泡携带抗体主动寻靶，在一定强度的超声辐照下靶向击破微泡，释放出抗体从而作用于机体的免疫系统，使免疫系统活化而达到增强免疫和抗肿瘤的效果。

肿瘤的免疫治疗有多年的历史，但一直未成为主要的治疗手段。近几年，针对免疫检点的单抗治疗不断在癌症治疗中取得突破性进展，尤其是在黑色素瘤、肾癌、肺癌和膀胱癌等多种肿瘤治疗中显示出很好的疗效。PD-1作为重要的共刺激抑制分子，在免疫系统中扮演着类似“刹车”的角色[21]，主要在激活的T细胞和B细胞中表达，其配体包括PD-L1和PD-L2，PD-L1主要在免疫细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞)和上皮细胞(如肿瘤细胞)上诱导表达，而PD-L2主要在抗原提呈细胞上表达。机体的肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞高表达PD-L1，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，PD-1和PD-L1连接后，T细胞的功能被抑制，因此PD-1/PD-L1抑制T细胞活化在肿瘤微环境中发挥重要的作用[22，23]。MPDL3280A(RG7446)是抗PD-L1的单克隆抗体，适用于PD-L1阳性患者。有学者[24]在2015 美国癌症协会(AACR)的年会上指出，MPDL3280A在晚期三阴性乳腺癌中表现出了持久的疗效。PD-1/PD-L1免疫疗法，是当前抗肿瘤治疗的热点，但尚未有将抗PD-L1的单克隆抗体与微泡连接用于治疗乳腺癌的研究报道。

综上所述，超声微泡可提高肿瘤细胞膜的通透性、对血管内皮和邻近肿瘤组织造成机械损伤，增加内皮间隙。超声微泡可靶向递送紫杉醇等化疗药物，降低药物毒副作用，提高肿瘤局部的药物浓度，增强化疗药对肿瘤细胞的杀伤力。超声微泡可将外源基因导入乳腺癌细胞，以纠正靶细胞的功能缺陷，促进细胞凋亡。超声微泡可通过靶向递送单克隆载体进行免疫治疗，活化免疫系统，增强机体免疫能力，抑制肿瘤的发生发展。目前关于携带有肿瘤实质细胞靶点的载药载基因的微泡鲜有报道。因此，进一步研究应发现安全、高效的针对肿瘤实质细胞靶点，提高超声微泡靶向治疗的精准性。

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湖北省重点实验室开放基金资助项目(2016KZL09)。

赵云(E-mail: zhaoyun@ctgu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.033

R737.9

A

1002-266X(2017)19-0105-04

2016-12-16)