水城县米箩乡中华蟾蜍的分子鉴定

熊荣川 喻廷君 李正富 曹 东 任梅梅 詹秀秀

（1六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水553001；2六盘水市生物研究所，贵州六盘水553001；3贵州大学昆虫研究所，贵阳550025；4水城县石丫口小学，贵州六盘水553000）

中华蟾蜍（Bufo gargarizans）隶属蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍属（Bufo），包含三个亚种，即指名亚种（Bufo gararizans gararizans）、华西亚种（Bufo gararizans andrewsi）以及岷山亚种（Bufo gararizans minshanicus）。中华蟾蜍在贵州省记载有两个亚种，即指名亚种（Bufo gararizans gararizans）及华西亚种（Bufo gararizans andrewsi）。指名亚种分布于遵义、绥阳、正安、仁怀、赤水、江口、印江、德江、松桃、水城、毕节、大方、金沙、雷山、贵定、贵阳、务川等地；而华西亚种分布于威宁、兴义、荔波、绥阳、江口等（费梁等，2009）。已有的分子遗传研究报道了绥阳、江口和威宁种群的分子数据，3个种群分别属于不同的支系（Fu J Z等，2005；Zhan A B，Fu J Z，2011；熊荣川 等，2014）。本研究针对采自贵州省水城县米箩乡的蟾蜍标本进行DNA提取，并克隆其线粒体16S rRNA基因，对其物种进行准确而有效的鉴定。

1 材料与方法

1.1 标本信息

研究材料于2014年6月1日采自贵州省水城县米箩乡石丫口民裕小学附近（标本号：LPSSC130563、LPSSC130564），标本保存于六盘水师范学院生物科学与技术学院标本馆。

1.2 总DNA提取及目的基因片段的扩增

取标本腿部新鲜肌肉组织适量，经90%浓度酒精固定后，使用动物组织DNA提取试剂盒（FOREGENE，DE-05011：250 Preps）提 取 总DNA，-20℃保存备用。

扩增引物为1对无尾两栖动物通用的线粒体16S rRNA片段扩增引物（Simons C等，1994）。所扩增目的序列对应中华蟾蜍线粒体基因组（Genbank索取号KM587710）2135-2675bp区间位置，对应中华蟾蜍16S rRNA全基因（Genbank索取号KM587710）856-1396bp区间位置。

PCR反应条件：反应体积为50 ul，其中北京全式金公司配备反应缓冲液2×EasyTaq PCR Super-Mix 25 ul，总DNA模板2 ul（含10～100 ng），上、下游引物各2ul（10 uM），用ddH2O补足50 ul。扩增PCR反应程序为94℃预变性4 min；94℃变性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环次数为35次；72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送测序公司测序。

1.3 参考基因序列下载及系统发育分析

所测得的中华蟾蜍16S基因序列经过上传GenBank进行搜索比对（Megablast）获得100条初步的参考序列，与待定基因序列一起构成数据集。进行系统发育分析时不预先设定外群，构建一棵无根系统发育树。用MUSCLE（Edgar R C，2004）程序对序列进行比对，辅以人工校对。使用raxmlGUΙ1.3（Silvestro D，Michalak Ι，2012）软件构建最大似然树，使用Mrbayes3.2（Ronquist F等，2012）构建贝叶斯树。在jModelTest 2（Darriba D等，2012）中筛选最适合该数据集序列演化模型以供最大似然法（Maximum likelihood，ML）分析和贝叶斯分析（Bayesian inference methods）。根据AΙC标准，适合本数据集的模型TΙM2+Ι+G。使用构建最大似然树（maximum likelihood tree），由于该软件不支持TΙM2+Ι+G模型，使用次优模型GTR+Ι+G，其中Ι=0.462，G=0.567。最大似然树支持率大于75%表明该支系关系得到充分解决，在50%～70%之间为中度支持，否则视为未解决。贝叶斯树支持率大于95%表明该支系关系得到充分解决，在75%～95%之间为中度支持，否则视为未解决。

1.4 遗传距离的计算

选用MEGA6（Tamura K等，2013）分析各序列间差异，依据Kimura2-parameter模型计算两两序列间的遗传距离以及主要支系间的平均遗传距离。

2 研究结果及分析

2.1 PCR扩增及测序结果

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，引物P7/P8扩增到560bp左右的基因片段（GenBank索取号：KX870122，KX870123）。基因序列（单链）碱基组成存在明显的偏向性：AT含量较高（A：30.6%，T：25.5%）；GC含量较低（G：19.7%，C：24.2%）。

2.2 支系分化

将所测得蟾蜍16S基因序列提交Genbank进行搜索比对，其与Genbank中的已有中华蟾蜍序列相似度最高，下载搜索得到的100条同源序列与待鉴定目标序列构成16S序列数据集。基于该数据集构建的系统发育树中（图1），56条来自Bufo bufo和Bufo eichwaldi参考序列聚为一个单系，将之设置为外群；另外包含目标序列在内的46条序列构成一个支持率较高的单系，该单系在系统发育分析中作为内群（各序列的Genbank索取号及采集地点已标注于图1）。

基于最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树拓扑结构基本一致（图1），内群内部均聚为7个主要支系：支系L.A包含了中华大蟾蜍水城种群、中国东部、北部地区种群以及四川康定和丹巴两种群（支系内遗传距离均值0.008）；支系L.B主要包含了中华大蟾蜍俄罗斯远东种群、韩国种群以及中国东北部地区种群（支系内遗传距离均值0.003）；支系L.C主要包含了中华大蟾蜍云南昆明种群；支系L.D主要包含了中华大蟾蜍云南怒江、中甸及四川石棉种群（支系内遗传距离均值0.005）；支系L.S主要包含了分布于中国辽宁和韩国江原道地区的史氏蟾蜍（Bufo stejnegeri）种群（支系内遗传距离均值0）；L1和L2为两个日本蟾蜍支系（支系内遗传距离均值分别为0.018和0.014）。

基于16S序列的遗传距离（表1）表明，内外群间平均遗传距离为0.059；内群各支系间平均遗传距离为0.028～0.051.

图1 基于16SrRNA的蟾蜍类物种的最大似然树。支系附近数字表示各主要支系的支持率（最大似然率/贝叶斯后验概率），-表示没有数据。Fig.1 The maximum likelihood(ML)tree based on the 16SrRNAfromBofospecies.Numbers around the branches are statistical supports(ML bootstrap values/Bayesian posterior probability),-means no available data.

表1 本研究中内群各支系间平均遗传距离Table 1 The average genetic distances among the lineages of the ingroup in this study.

3 结论及讨论

本研究成功扩增了水城县米箩乡分布蟾蜍的线粒体16S rRNA基因，经过系统发育分析，其与44条蟾蜍序列构成一个支持率较高的单系群，该单系群进一步分化为7个主要支系，水城种群所在的L.A支系最大似然法支持率较低（41）；但得到贝叶斯推断法的中度支持（0.83）。同时，该支系内部序列间平均遗传距离为0.008，远小于该支系与其他支系间的平均遗传距离（0.29～0.42），因此可以初步判断水城种群与该支系内其他种群为同一个物种。

支系L.A包含的序列分别被原始研究鉴定为中华蟾蜍（Bufo gargarizans）（Liu W Z等，2000；Jiang J P，Zhou K Y，2005；Cao S等，2006；Ιgawa T等，2006；Yang J等，2015）、盘古蟾蜍（Bufo bankorensis）（Liu W Z等，2000；Ιgawa T等，2006；Recuero E等，2012）、西藏蟾蜍（Bufo tibetanus）（Wang X等，2013）。然而有研究认为盘古蟾蜍和西藏蟾蜍是中华蟾蜍的同物异名（Matsui M，1986；Liu W Z等，2000；Zhan A B，Fu J Z，2011），因此支系L.A的物种应为中华蟾蜍，由此得出采自水城米箩乡的蟾蜍标本为中华蟾蜍（Bufo gargarizans）。

参考文献：

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