六盘水红豆杉植物化学成分预试及其氨基酸组成

王绪英 龙永游 邓 黔

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水553001）

红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物为国家Ι级重点保护野生植物（国家林业局和农业部，1999），全世界红豆杉属有11种，我国有4种1变种。红豆杉(Taxus chinensis)为我国特有种，产于甘肃南部、陕西南部、四川、云南东北部及东南部、贵州西部及东南部、湖北西部、湖南东北部、广西北部和安徽南部，常生于海拔1 000～1 200 m以上的高山上部（中国科学院植物研究所编辑委员会，1978）。红豆杉是珍贵的抗癌植物，对颈部肿瘤、胃癌、肺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等有较好疗效,同时还具有降低胆固醇、抗炎等功能（陆顺能和潘祯阳，2012）。红豆杉属不同种的植物化学成分含量不但随种类、部位的不同具有一定的差异，而且同一种因生于不同地域环境，其化学成分含量也有差异（张洁等，2008）。经过考察，六盘水市内红豆杉分布广，以盘州市分布最集中（左经会等，2013；朱军等，2013）。对六盘水分布的野生红豆杉进行化学成分预试，对不同部位的蛋白质含量及氨基酸种类进行定性研究，为进一步开发六盘水红豆杉产业提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：红豆杉采自贵州省六盘水市盘州市保基乡老马冲（海拔：2 048 m），将其茎、皮、叶阴干，粉碎，备用。

试剂：茚三酮、乙醇、丙酮、a-萘酚、浓硫酸、乙酸酐、磷钼酸、三氯化铁、冰醋酸、硼酸、浓盐酸、镁粉、氯仿、氢氧化钠、盐酸、溴酚蓝、过氧化氢、硼酸、稀氨水、硫酸、氯化汞、碘化钾、正丁醇、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸均为分析纯。

仪器：DFT-200粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；BOXUN烘箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；DZKW-4恒温水浴锅(上海科析试验仪器厂)；UV紫外灯(合肥塞帆实验设备有限公司)；PHS-2C PH计(姜堰市新康医疗器械有限公司)；KDN型定氮仪HYP-10系统消化装置(上海纤检仪器有限公司)；KDN型定氮仪102C型蒸馏装置(上海纤检仪器有限公司)；BS423S塞多利斯科学仪器电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 红豆杉化学成分预试

1.2.1.1 水浸液的浸提：称取茎粉末4 g于烧杯中，加40 mL去离子水浸泡过夜。

1）氨基酸的预试

取2～3滴茚三酮试剂加入1 mL冷浸液中，摇匀，沸水浴加热5 min，冷却后观察；还原糖、多糖和甙的预试，采用a-萘酚试验，取2～3滴a-萘酚乙醇液加入1 mL热浸液中，摇匀，加入少量浓硫酸，观察结果。

2）皂甙的预试

（1）采用泡沫试验：取1～2 mL热浸液，激烈震荡，产生大量蜂窝状泡沫，放置10 min后，加入乙醇，观察结果。

（2）乙酸酐-浓硫酸反应：取乙醇液1～2 mL，蒸发乙醇，用乙酸酐溶解残渣，加1滴浓硫酸，观察结果。

（3）挥发油的预试：取水浸液滴在滤纸上，喷5%磷钼酸水溶液，热风吹1 min，观察结果。

1.2.1.2 醇提取液的浸提：称取茎粉末5 g，加入60 mL 95%乙醇，放入索式提取器中水浴加热回流提取20 min。

1）酚类化合物和鞣质的预试，将醇提取液用乙酸酸化，取1 mL，加1%三氯化铁1～2滴，观察结果；黄酮类化合物的预试，取1 mL醇提取液，加少许镁粉，再滴入数滴浓硫酸，观察结果；甾体、三萜类化合物的预试，氯仿-浓硫酸反应：将醇提取液溶解于氯仿，加浓硫酸，观察结果；内酯和香豆素的预试：（1）荧光试验：取醇提取液于滤纸上，置于紫外灯下观察，是否有蓝色荧光，观察结果；（2）开环-闭环试验：加1%氢氧化钠于醇提取液中，观察醇提取液是否变澄清，再加2%盐酸，观察醇提取液是否变浑浊。

2）有机酸的预试

（1）pH计检测：用pH计检查醇提取液的pH。

（2）溴酚蓝试验：取醇提取液于滤纸上，喷洒1%溴酚蓝乙醇液，观察结果。

3）蒽醌类的化学预试

（1）1%硼酸水溶液试验：取醇提取液于滤纸上，喷洒1%硼酸，观察结果。

（2）碱性试验：取1 mL醇提取液于试管，加1 mL 1%氢氧化钠，观察是否显现出红色，接着加少量30%过氧化氢并加热，看红色是否褪去，再加酸液酸化，观察结果。

1.2.1.3 酸提取液的浸提:称取茎粉末2 g，加0.5%盐酸乙醇10 mL，放置于索式提取仪器中水浴加热回流提取10 min。

生物碱的预试：先用稀氨水将酸提取液调至中性，水浴蒸干，再加5%硫酸4 mL溶解残渣，过滤，取滤液1 mL，加1～2滴碘化汞钾试剂，观察结果。

1.2.2 红豆杉样品制备

称取红豆杉茎、皮、叶粉末各1 g分别装入消化管中，加入15 g加速剂和25 mL浓硫酸，摇均。同样做一份空白对照(不加样品)，消化完全冷却，加入10 mL去离子水蒸馏。当加入15 mL硼酸—混合指示剂的锥形瓶体积达到100～150 mL时，取下锥形瓶。

1.2.3 红豆杉中蛋白质的酸水解

称取0.4 g红豆杉粉末，放入聚乙烯管，加入2 mL 6 moL/L盐酸，在110℃干燥箱中水解20 h，将水解液倒入蒸发皿中，沸水浴加热除去盐酸，蒸干溶于2 mL 10%异丙醇中。

1.2.4 红豆杉蛋白质含量测定

用已知浓度的酸滴定蒸馏接收液，记录消耗盐酸体积，滴定2次，按下列公式计算样品中蛋白质含量：

粗蛋白质含量=[(V2-V1)×0.05×0.014 0×6.25]/[(W×V'/V)×100]×100%

式中，V2为滴定试样时消耗标准酸体积；V1为滴定空白时消耗标准酸体积；0.05为标准酸溶液浓度；6.25为氮换算成粗蛋白质的系数；W为试样重量；V'为试样分解液蒸馏所用体积；V为试样分解液总体积；0.014 0为氮的毫克当量数。

1.2.5 红豆杉中氨基酸的纸层析法

将标准氨基酸和蛋白质样品点于层析滤纸的标记位置，进行层析，层析后电炉上烘干滤纸。用0.5%的茚三酮正丁醇溶液显色。

2 结果与分析

2.1 红豆杉植物成分的检测

预试结果见表1。

表1 红豆杉预试液中植物化学成分的检测

由表1可知，红豆杉植物中含有蛋白质（氨基酸、多肽或脯氨酸）、还原糖、多糖和甙、皂甙、挥发油、酚类化合物和鞣质、黄酮类化合物、甾体、三萜类化合物、内酯、香豆素、强心甙、有机酸、蒽醌类和生物碱；不含氰甙和油脂。

2.2 蛋白质含量测定

取红豆杉茎、皮、叶各1 g，用凯氏定氮法测定蛋白质含量，结果见表2。

由表2可知，蛋白质含量由高到低依次为茎、叶、皮。

表2 红豆杉茎、皮、叶中蛋白质含量

2.3 纸层析法测定红豆杉叶中氨基酸种类

用纸层析法测定红豆杉中氨基酸种类结果见图1。由图1、图2、图3可知红豆杉茎、叶、皮中都含组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。

图1 红豆杉叶提取物纸层析图谱

图2 红豆杉树皮提取物纸层析图谱

图3 红豆杉茎提取物纸层析图谱

3 结论与讨论

目前，红豆杉研究主要集中在抗癌成分紫杉醇的提取纯化（苏应娟等，2000；王达明，2004；郑德勇，2003；卫强和孙涛，2016）、繁殖技术和遗传多样性(张蕊等，2009，2011;任旻琼等，2009;李乃伟等，2010)、适宜栽培区的研究（李鸿杰等，2014）、栽培技术以及组培研究（刘新星 等，2015），关于其营养成分的研究很少有人涉及。

本研究发现红豆杉植物中含有蛋白质(氨基酸、多肽或脯氨酸)、还原糖、多糖和甙、皂甙、挥发油、酚类化合物和鞣质、黄酮类化合物、甾体、三萜类化合物、内酯、香豆素、强心甙、有机酸、蒽醌类和生物碱；不含氰甙油脂。红豆杉茎、叶、皮中均含有组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸，蛋白质含量由高到低依次为茎、叶、皮。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，是构成人体最基本的物质之一，是生命代谢的物质基础，氨基酸不仅具有重要的营养价值，每种氨基酸还具有特定的药理功能，通过对红豆杉中化学成分的研究，进一步挖掘红豆杉非药用成分的营养功能，以期为红豆杉开发成为药食功能产品提供参考。

参考文献：

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