大肠埃希菌耐药机制的研究进展

虞春华，丁岚，柯慧，马嫚，高建华综述，夏小明审校

(江西医学高等专科学校病原生物教研室，江西上饶334000)

·综述·

大肠埃希菌耐药机制的研究进展

虞春华，丁岚，柯慧，马嫚，高建华综述，夏小明审校

(江西医学高等专科学校病原生物教研室，江西上饶334000)

大肠埃希菌是感染性腹泻常见的病原菌，由于抗生素的滥用，使大肠埃希菌的耐药性越来越严重，其耐药谱也不断发生变化，对临床合理使用抗生素提出了更高和更为迫切的要求。本文就大肠埃希菌耐药状况及耐药机制等方面的研究作一综述。

大肠埃希菌；抗生素；耐药机制

大肠埃希菌是存在于人类和动物肠道中的一类正常菌群，也是肠杆菌科埃希菌属中最重要的细菌，当机体免疫力低下或菌侵入肠外组织或器官，可引起肠外感染。某些菌株具有毒力因子，能直接引起肠道感染。近些年，大肠埃希菌的耐药株不断增多，大肠埃希菌的耐药性越来越严重，致病性大肠埃希菌特别是多重耐药大肠埃希菌临床监测分离率也逐年升高，给感染性疾病的预防和治疗带来了现存的和潜在的危机，细菌耐药已成为一个全球性问题。大肠埃希菌的耐药性更是如此，且其耐药谱在不断发生变化，耐药性产生的原因也是多方面的。如何合理使用抗生素，了解大肠埃希菌耐药菌的产生机制，控制多重耐药菌株的产生和传播，已成为急需解决的问题。

1 大肠埃希菌的耐药现状

上世纪六十年代多重耐药大肠埃希菌较少见，随着抗生素的普遍应用和滥用，70年代开始出现多重耐药菌且耐药谱也不断发生变化，不同地区不同时间出现的耐药情况也不一样。国内外相关研究表明，大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性上升趋势出现差异，其中对链霉素、复方磺胺、四环素、氨卞西林、壮观霉素的耐药率上升明显[1]。临床上多重耐药菌株的检出率也逐渐增加[2]，王会中等研究发现[3]大肠埃希菌除对亚胺培南和美罗培南耐药率较低外，对哌拉西林／他唑巴坦的耐药率也较低；大部分的多耐药大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，且多为CTX-M型[4]；翁幸鐾等[5]从尿液中分离出aac(6’)-I b基因新亚型的大肠埃希菌，杨大亮等[6]研究的178株耐药性大肠埃希菌在急诊科和泌尿科的分布为26.40%和21.91%，对氨苄西林的耐药性为94.3%。2014年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示，肠杆菌科细菌大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌以及奇异变形杆菌中产ESBLs菌株的检出率分别为55.8%、29.9%和24.0%，大肠埃希菌的检出率最高。大肠埃希菌中产ESBLs株有所增多为55.8%对54.0%，同时大肠埃希菌对环丙沙星、庆大霉素、哌拉西林和磺胺的耐药率均接近或高于50%，与往年相近，对3种碳青霉烯类的耐药率仍然较低[7]。高明祥等[8]研究发现大肠埃希菌ESBLs阳性发生率达75.1%，故研究大肠埃希菌感染现状，对控制耐药菌株的蔓延及临床合理用药具有十分重要的意义。

2 大肠埃希菌的耐药机制

细菌的耐药机制复杂多样，原因主要有：某些细菌天生就有或者通过自发突变产生耐药基因；细菌通过质粒或转位因子等将耐药基因进行细菌间转移。大肠埃希菌的耐药机制主要表现为产生水解酶或钝化酶水解或修饰抗菌药物而使药物失活；改变抗菌药物的作用靶位；细菌细胞膜通透性改变（如孔蛋白减少、生物被膜的形成），减少了药物的摄取和吸收；细菌主动外排功能的增强，使抗生素在菌体内达不到有效杀菌浓度及质粒介导的耐药性等。大肠埃希菌对不同类抗生素的耐药机制如下有下列几类。

2.1 细菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制产β-内酰胺酶是大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，Ambler根据酶分子结构的不同，将β-内酰胺酶分为A、B、C和D四类：A、C、和D类酶的活性位点是丝氨酸，B类活性结构为锌，A和D类酶能被抑制剂所抑制。Bush K等[9]又将β-内酰胺酶分为四型。Ⅰ型为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶，Ⅱ型能被抑制剂所抑制，Ⅲ型为不被抑制剂所抑制的金属内酰胺酶，Ⅳ型为不被克拉维酸抑制的青霉素酶。以Ⅰ型和Ⅱ型尤为重要，Ⅰ型为染色体和质粒介导产生的头孢菌素酶型（Ampicillin，AmpC）β-内酰胺酶，Ⅱ型是由质粒介导产生的超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）。目前在大肠埃希菌中发现的主要有超广谱β-内酰胺酶、AmpC型酶和碳青霉烯酶金属酶。AmpC酶是一种不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制的水解酶，AmpC酶的出现使得临床对革兰阴性致病菌所能使用的抗生素范围进一步缩小，该类酶主要作用于青霉素和第一、二、三代头孢菌素，以及单环类抗生素，而第四代头孢菌素及碳青霉烯类不受该酶作用。对β-内酰胺酶抗生素耐药则主要是由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶所致，大肠埃希菌对β-内酰胺类抗生素耐药主要是由ESBLs引起的。ESBLs是指由质粒介导的能赋予细菌水解头孢菌素类、单酰胺类抗生素以及青霉素类药物的一类β-内酰胺酶，根据基因同源性不同，ESBLs可分为五大类：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型，其中TEM型酶（Temoniera）是最常见的质粒介导的酶，能使细菌对第一代和第二代头孢菌素耐药。CTX-M型酶是国内流行最广泛的超广谱β-内酰胺酶，迄今已发现64种，其主要分布于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，国内外相继有各种基因检测的报道，黄靖宇等[10]人研究显示大肠埃希菌携带SHV、TEM、DHA-1、ACT-1耐药基因比率较高，且临床检出的多重耐药菌逐年升高。碳青霉烯酶是指所有能水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类药物的一类β-内酰胺酶，分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。A类碳青霉烯酶为丝氨酸酶，其作用机制是利用活性位点丝氨酸残基灭活β-内酰胺类抗生素。B类碳青霉烯酶又称金属β-内酰胺酶，简称金属酶，其作用机制是依赖于活性部位的锌离子和β-内酰胺类药物之间的相互作用。目前在大肠埃希菌属已经发现的B类碳青霉烯酶有IMP、VIM、NDM 3种[11]。D类碳青霉烯酶也是一种丝氨酸蛋白酶，因其可以水解苯唑西林和氯唑西林，又称为OXA类β-内酰胺酶。D类碳青霉烯酶可被克拉维酸和他唑巴坦抑制，但克拉维酸对其抑制作用差[12]。目前发现存在于大肠埃希菌属的OXA酶包括OXA－1、OXA－2、OXA－48等。

碳青霉烯酶抗生素对大多数致病菌呈现强抗菌作用，故被认为是治疗产ESBLs和AmpC酶菌株所致严重感染的优选药物之一。以往碳青霉烯类药耐药株多为铜绿假单胞菌等非发酵类细菌[13]，近年来有关大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物耐药的报道也越来越多。胡丽庆等人研究报道2007－2009年，大肠埃希菌产ESBLs株对亚胺培南的耐药率从0.2%上升至1.4%，对美罗培南的耐药率从0%上升至0.9%，呈逐年上升趋势[14]2016年胡志军等人研究结果显示大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物耐药率达到1.7%[15]。

2.2 对氨基甙苷类抗生素的耐药机制氨基甙苷类抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，其杀菌谱广，临床常用的主要为丁胺卡那霉素阿米卡星、妥布霉素和庆大霉素等，但随着氨基甙类抗生素在临床上的广泛使用，细菌对该类抗生素耐药性不断增加，不同地区不同时间内氨基糖苷类抗生素耐药情况不尽相同。氨基甙类抗生素主要作用于细菌的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细菌细胞膜的完整性。大肠埃希菌对氨基甙类抗生素产生耐药主要通过以下三方面：

⑴氨基苷甙类钝化酶的产生。产生氨基甙苷类钝化酶（aminoglycoside modifying enzyme，AMEs）是临床菌株对氨基甙苷类抗生素产生耐药性的最主要的原因。氨基甙苷类钝化酶作用于特定的氨基或羟基，从而使药物发生钝化。该钝化酶由质粒和染色体所编码，通常由可移动DNA片段携带，质粒的交换和转座子的转座可使耐药基因整合至敏感菌的遗传物质上，而且这些酶的基因决定簇即使在没有明显遗传关系的细菌种群间也能传播。目前已发现的氨基甙苷类钝化酶有30多个基因型。氨基甙苷类钝化酶作用于抗生素特定的氨基或羟基后，抗生素与细菌核糖体结合不紧密而不能进入下一阶段发挥抗菌作用，从而使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活[16]。不同的氨基甙类抗生素可为同一种酶所钝化，而同一种抗生素又可为多种酶所钝化，这是因为一种抗生素的分子结构中可能存在多个结合位点之故，所以不同地区和不同时间氨基甙苷类耐药菌的耐药机制有很大差异。

⑵作用靶位的改变。细菌与抗菌药物结合的有效部位发生变异，从而降低了细菌对抗菌药物的敏感性而产生耐药。细菌通过产生诱导酶对菌体（即抗菌药物的作用靶位）进行化学修饰，或通过基因突变造成而至靶位变异导致耐药。氨基糖苷类抗生素的结合点在核糖体上，而核糖体是编码蛋白质的中枢，是受细胞自身的严格保护的。通过改变作用靶位，使抗生素进入细菌后不能与之结合而发挥作用，这种情况较少见。但rRNA特定的突变是造成氨基甙苷类钝化酶耐药性的一个重要原因[17]。王会中等人[18]研究发现导致大肠埃希菌对氨基甙苷类抗生素耐药的机制主要是产生16S rRNA甲基化酶(Anna或RmtB)。

⑶细胞壁通透性改变或细胞内转运异常。这种情况导致药物摄取与积累的减少，从而使细菌耐药。

2.3 对喹诺酮类抗生素的耐药机制喹诺酮类药物是近30年来发展十分迅速的一类抗菌药物，目前已经发展到第四代，因其抗菌谱广、抗菌活性强、使用方便和剂型较多等优点，在国内外临床控制感染性疾病中已普遍应用。与此同时，细菌对此类药物的耐药性也呈蔓延趋势。2004至2005年度卫生部全国细菌耐药监测网监测结果显示，大肠埃希菌对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率分别为56.7%、64.9%；2011至2012年度卫生部全国细菌耐药监测网监测结果显示，大肠埃希菌对左氧氟沙星、环丙沙星的耐药率分别为61.6%、65.7%。在我国临床分离的大肠埃希菌对喹诺酮类抗生素的耐药率处于全球前列[19]。大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要为染色体介导和质粒介导[20]，细菌对喹诺酮类药物耐药的机制主要有以下三方面：

⑴药物作用靶位的结构基因突变致DNA促旋酶（gyrase，gyr）和拓扑异构酶Ⅳ（topoisomerase）突变。喹诺酮类抗生素主要作用于DNA促旋酶和拓扑异构酶，细菌对喹诺酮类药物的耐药性机制主要是细菌染色体基因突变，导致药物作用靶位DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的结构和构象发生变化，使药物不能与酶和DNA复合物稳定结合。DNA促旋酶为喹诺酮类抗革兰阴性菌的第一靶位，DNA促旋酶A亚单位变异是细菌产生耐药的主要原因。茆海丰等人研究[21]结果显示62株大肠埃希菌中有36株发生gyrA基因变异，parC基因突变共42株，所有gyrA基因的变异均同时发生parC基因突变。

⑵细菌细胞膜通透性改变。喹诺酮类药物必须进入菌体内才会发挥抗菌作用，药物到达靶位需经细胞外膜。革兰阴性菌的外膜是抵御外来毒物的有效屏障，这种屏障作用与外膜的孔蛋白和脂多糖有关。细胞膜通透性改变后，如孔蛋白的缺失和突变，外膜通透性下降就会阻碍抗生素进入细菌内膜，从而导致细菌产生耐药。

⑶控制细菌主动外排系统的调控基因突变导致主动外排增强。当泵系统的基因被激活，细菌外排药物的功能就增强。

2.4 对磺胺和甲氧苄氨嘧啶的耐药机制二氢叶酸合成酶（dihydropteroate synthase，DHPS）和二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是细菌叶酸生物合成途径中重要的酶。磺胺可与化学结构相似的对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，使二氢叶酸合成减少，甲氧苄氨嘧啶则与二氢叶酸还原酶相互作用，使四氢叶酸的生成受阻，抑制细菌的生长繁殖。临床上甲氧苄氨嘧啶与磺胺的联合应用可使细菌的叶酸代谢双重受阻，增强抗菌作用。自1968年两种药物广泛联用以来，到20世纪70年代中，在临床上相继出现了耐药现象，细菌编码二氢叶酸合成酶的耐药基因有三种，sul1、sul2和sul3。耐甲氧苄氨嘧啶基因（dihydrofolate reductase，dfr）目前已检测到30多种，这两类基因大多位于Ⅰ类整合子上。对于dfr基因可分为1型和2型或dfrA和dfrB[22]。王伟等[23]研究发现临床分离的大肠埃希菌携带有sul1、dfrA1、dfrA17基因。

综上所述，大肠埃希菌耐药机制复杂，且多种耐药机制可协同作用，造成耐药水平高及多重耐药的现象。临床上耐药性大肠埃希菌的感染，特别是多重耐药现象日趋严重，正确选用抗生素是治疗的关键，也是防止耐药菌株蔓延的关键。对大肠埃希菌的耐药性监测需要加强，同时合理使用抗生素，努力消除细菌的耐药性，是当前防治工作中急需解决的问题。

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R446.5，Q939.92

A

1674-1129(2017)02-0215-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.024

2016-09-06；

2016-12-27)

江西省教育厅科学技术研究项目，编号：151344

虞春华，女，1975年生，医学硕士，副主任技师，微生物专业，研究方向肠道杆菌的耐药性。

夏小明，男，1963年生，主任医师，研究方向为细菌的耐药性研究。